EIF5A2在結直腸癌細胞中的表達及在5-Fu化療抵抗中的作用

范永胂，暢銀娟

（1.浙江醫院 肛腸科，浙江 杭州 310013；2.浙江大學附屬婦產科醫院 婦科，浙江 杭州 310000）

·基 礎 研 究·

EIF5A2在結直腸癌細胞中的表達及在5-Fu化療抵抗中的作用

范永胂1，暢銀娟2

（1.浙江醫院 肛腸科，浙江 杭州 310013；2.浙江大學附屬婦產科醫院 婦科，浙江 杭州 310000）

目的：探討EIF5A2在結直腸癌細胞中的表達及在化療抵抗中的作用。方法：培養對數生長期的人結直腸癌細胞系LOVO、SW480及DLD1，用Western blot法測定三種結直腸癌細胞系中EIF5A2的表達。將人結直腸癌LOVO細胞在濃度為0.2 μg/L的5-Fu中培養48 h，用Western blot法測定EIF5A2的表達。EIF5A2-siRNA轉染LOVO細胞，將轉染后的LOVO細胞及結直腸癌LOVO細胞在0.2 μg/L的5-Fu中培養48 h，用MTT法測定細胞生長抑制率。結果：EIF5A2在三種結直腸癌細胞系中均有表達，在LOVO細胞中表達量最高（P＜0.05）。結直腸癌LOVO細胞在5-Fu中培養48 h后 EIF5A2表達明顯增強（P＜0.05）。EIF-5A2-siRNA轉染LOVO細胞后增加了5-Fu的細胞抑制率（P＜0.05）。結論：EIF5A2在人結直腸癌細胞中有表達，并且增強了5-Fu的化療抵抗力。

結直腸腫瘤；EIF5A2；5-氟尿嘧啶；化療抵抗

結直腸癌是導致癌癥相關死亡的最常見病因，每年約有超過1千萬人罹患此病[1]。5-Fu聯合其他藥物化療可以顯著提高患者生存率[2]，然而化療抵抗給結直腸癌的治療帶來了巨大挑戰。EIF5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2）是一種真核生物翻譯起始因子，是Guan等[3]從卵巢癌中分離出的一種原癌基因。研究表明EIF5A2蛋白的高表達與結直腸癌血管淋巴管浸潤、較晚的分期和腫瘤遠處轉移有關[4]，是預后不良的獨立危險因素[5]。但EIF5A2和化療抵抗的關系及其機制目前研究較少，所以在本實驗中，我們將檢測EIF5A2在三種不同的結直腸癌細胞系中的表達情況，并初步探討EIF5A2在5-Fu化療抵抗中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞系LOVO、SW480、DLD1由本院實驗室保存。RPMI 1640培養基、胎牛血清（FBS）購自GIBCO公司。抗EIF5A2抗體、EIF5A2-siRNA購自武漢晶賽公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人結直腸癌細胞均在含10%胎牛血清的RPMI1640培養液中，飽和濕度、37 ℃及5% CO2培養箱內常規傳代培養。待細胞生長至約70%至90%融合狀態時用于實驗。

1.2.2 Western blot法檢測結直腸癌細胞EIF5A2表達情況：收集對數生長期細胞LOVO、SW480及DLD1，加入PBS液漂洗，后加入裂解液裂解，在4 ℃、6 700 r/min下離心2 min，收集裂解物總蛋白；將蛋白溶液和5×上樣緩沖液按5∶1混合煮沸5 min，按每孔20 μL上樣進行電泳并轉印至PVDF膜，經5%的脫脂奶粉封閉后，與兔抗EIF5A2（1∶1 000）和內參照GAPDH（稀釋1∶10 000）多克隆抗體分別孵育，再與羊抗兔二抗（稀釋1∶5 000）反應，增強化學發光法顯影，與內參照進行灰度比較以半定量分析。該實驗重復3次，分析三種結直腸癌細胞系中EIF5A2表達情況。

1.2.3 5-Fu干預結直腸癌細胞LOVO對EIF5A2表達的影響：結直腸癌細胞LOVO在0.20 μg/L的5-Fu中培養48 h后，Western blot法（如步驟1.2.2所述）檢測LOVO細胞內EIF5A2的表達。

1.2.4 EIF5A2-siRNA轉染LOVO細胞后EIF5A2的表達：EIF5A2-siRNA轉染結直腸癌細胞系LOVO，按照Lipo-fectamine 2000說明書進行瞬時轉染。轉染后24 h Western blot法檢測細胞內EIF5A2表達情況。

1.2.5 MTT法檢測不同細胞對5-Fu敏感性：取對數生長期的對照組LOVO細胞和EIF5A2-siRNA轉染組LOVO細胞，分別暴露于無5-Fu及濃度為0.2 μg/L的5-Fu中培養48 h，用MTT法自動酶標讀數儀測定每孔細胞吸光度（A值）。實驗設空白組、藥物實驗組及對照組，空白組只加細胞培養液，對照組加細胞和培養液。最后計算細胞生長抑制率（%）=[（對照組-實驗組）/（對照組-空白組）]×100%。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行分析。數據采用表示，組間比較采用Student’s t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三種結直腸癌細胞系中EIF5A2蛋白表達情況EIF5A2在直腸癌LOVO、SW480、DLD1細胞系中均有表達，在LOVO細胞系中表達最高，為（71.49± 0.79）%，SW480為（10.79±0.73）%，DLD1為（22.98± 0.81）%，在LOVO細胞系中EIF5A2的表達是SW480中的6.62倍，是DLD1細胞系中的3.11倍，LOVO細胞與其他2組細胞之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 5-Fu誘導結腸癌細胞LOVO中EIF5A2表達 將結直腸癌LOVO細胞暴露于0.2 μg/L的5-Fu中培養48 h，EIF5A2相對表達值為（75.20±0.67）%，與無5-Fu組的（71.49±0.79）%相比表達增強，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 LOVO、SW480、DLD1細胞系中EIF5A2的表達水平

2.3 EIF5A2-siRNA轉染后LOVO細胞后EIF5A2的表達 EIF5A2-siRNA轉染組LOVO細胞EIF5A2的相對表達量為（57.90±0.65）%，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），說明EIF5A2表達受到抑制。

2.4 EIF5A2-siRNA轉染LOVO細胞提高了對5-Fu的化療敏感性 在無5-Fu組中，EIF5A2-siRNA組細胞A值與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；0.2 μg/L的5-Fu作用實驗中，和對照組LOVO細胞相比，EIF5A2-siRNA組A值明顯低于未轉染組（P＜0.05，見表1），其對應的細胞生長抑制率分別為72.7%、27.2%，表明沉默EIF5A2可明顯增加5-Fu的化療敏感性，減輕化療抵抗。

表1 5-Fu作用于EIF5A2-siRNA轉染組和對照組LOVO細胞48 h的A值比較（）

表1 5-Fu作用于EIF5A2-siRNA轉染組和對照組LOVO細胞48 h的A值比較（）

與對照組LOVO細胞比：aP＜0.05

3 討論

EIF5A是真核細胞內包含翻譯后衍生氨基酸8-羥-2，7，10-三氨基葵酸的蛋白質，對于維持細胞增殖非常重要[6]。EIF5A基因家族的成員包括EIF5A1和EIF5A2，兩者編碼的蛋白質氨基酸序列有84%的一致性。EIF5A2位于人類染色3q26區，由5個外顯子和4個內含子組成，編碼含有125個氨基酸的EIF5A2蛋白[7]。在多種腫瘤中3q26染色體常表現擴增異常或不穩定，該現象暗示著染色體3q26區存在著腫瘤形成與轉移基因[8]。多個研究表明EIF5A2的過表達和肝癌[9]、結直腸癌[4]、卵巢癌[10]及肺癌[11]的預后呈負相關。

本研究表明EIF5A2在結直腸癌LOVO、SW480、DLD1細胞系中均有表達，LOVO中最高，DLD1、SW480次之，將結直腸癌細胞LOVO暴露于0.2 μg/L 5-Fu中48 h后EIF5A2的表達增強。同時我們將LOVO細胞EIF5A2表達沉默后作用于相同濃度5-Fu中，結果5-Fu對結直腸癌細胞的抑制率增加，5-Fu的化療抵抗性得到明顯改善，由此可以推斷EIF5A2可能是一種化療抵抗基因。

EIF5A2表達雖和化療抵抗相關，但其機制仍然不明。最近研究表明，EIF5A2可通過C-MYC上調轉移相關蛋白1誘導上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并增加結直腸癌細胞的侵襲轉移能力[4]。而許多證據顯示在乳腺癌[12]、卵巢癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]中化療抵抗和EMT都有聯系。因此，EIF5A2誘導EMT可能是結直腸癌細胞化療抵抗的途徑之一。所以，繼續研究這一課題將對結直腸癌的治療提供理論依據。

[1] Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, et al. Colorectal cancer [J]. Lancet, 2010, 375(9719): 1030-1047.

[2] Taieb J, Mini E, et al. Oxaliplatin, fluorouracil and leucovorin with or without cetuximab in patients with resected stage III colon cancer (PETACC-8): an open-label, randomized phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2014, 15(8): 862-873.

[3] Guan XY, Sham JS, Tang TC, et al. Isolation of a novel candidate oncogene within a frequently amplified region at 3q26 in ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2001, 61(9): 3806-3809.

[4] Zhu W, Cai MY, Tong ZT, et al. Overexperssion of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-MYC to induce epithelialmesenchy maltransition[J]. Gut, 2011, 61: 562-575.

[5] Xie D, Ma NF, Pan ZZ, et al. Overexpression of EIF5A2 is associated with metastasis of human colorectal carcinoma[J]. Hum Pathol, 2008, 39: 80-86.

[6] Guan XY, Sham JS, Tang TC, et al. Isolation of a novel candidate oncogene within a frequently amplified region at 3q26 in ovarian cancer[J]. Cancer Res, 2001, 61(9): 3806-3809.

[7] Jenkins ZA, Johansson HE. Human EIF5A2 on chromosome 3q25-q27 is a phyloenetically conserved vertebrate variant of eukaryotic translation initiation factor 5A with tissue-specific expression[J]. Genomics, 2001, 71(1): 101-109.

[8] Xie D, Ma NF, Pan ZZ, et al. Overexpression of EIF-5A2 is associated with metastasis of human colorectal carcinoma[J]. Hum Pathol, 2008, 39(1): 80-86.

[9] Tang DJ, Dong SS, Ma NF. Overexpression of eukaryotic initiation factor 5A2 enhances cellmotility and promotes tumor metastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2010, 51(4): 1255-1263.

[10] 楊麗君, 楊國奮, 何立儒, 等. 卵巢癌中EIF-5A2基因表達與臨床意義[J]. 中國腫瘤臨床, 2010, 37(14): 796-799.

[11] 周傳江, 楊雪鷹, 劉彩剛, 等. EIF-5A2在非小細胞肺癌和癌旁組織中的表達及意義[J]. 中國腫瘤醫學, 2012, 20(5): 941-945.

[12] Zhang W, Feng M, Zheng G, et al. Chemoresistance to 5-fluorouracil induces epithelial-mesenchymal transition via upregulation of Snail in MCF7 human breast cancer cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 417: 679-685.

[13] Marchini S, Fruscio R, Clivio L, et al. Resistance to platinum-based chemotherapy is associated with epithelial to mesenchymal transition in epithelial ovariancancer[J]. Eur J Cancer, 2013, 49: 520-530.

[14] Gungor C, Zander H, Effenberger KE, et al. Notch signaling activated by replication stressinduced expression of midline drives epithelial-mesenchymal transition and chemo-resistance in pancreatic cancer[J]. Cancer Res, 2011, 71: 5009-5019.

[15] Chen X, Lingala S, Khoobyari S, et al. Epithelial mesenchymal transition and hedgehog signaling activation are associated with chemoresistance and invasion of hepatoma subpopulations[J]. J Hepatol, 2011, 55: 838-845.

（本文編輯：丁敏嬌）

The expression of EIF5A2 in colorectal cancer cells and its role in 5-Fu chemoresistance

FAN Yongshen1,CHANG Yinjuan2. 1.Department of Anorectal, Zhejiang Hospital, Hangzhou, 310013; 2.Department of Gynecology, Women’s Hospital School of Medicine Zhejiang University, Hangzhou, 310000

Objective: To research EIF-5A2 overexpression in colorectal cancer and its effect on chemotherapy. Methods: EIF5A2 expression in colorectal carcinoma (CRC) line (LOVO, SW48 and DLD1) was measured by Western-blot. LOVO cells were cultured in 5-Fu for 48 hours, and EIF5A2 expression was measured by Western-blot. LOVO cells were treated with EIF5A2-siRNA and exposed to 0.2 μg/L 5-Fu for 48 hours. Cell toxicity was assayed by MTT. Results: EIF5A2 was expressed in all three different CRC and was highest in LOVO cells (P＜0.05). 5-Fu treatment led to elevated EIF5A2 expression (P＜0.05). The transfection of EIF5A2-siRNA could improve the inhibit rate of LOVO to 5-Fu (P＜0.05). Conclusion: EIF5A2 is expressed in CRC lines and it can enhance the chemoresistance of 5-Fu.

colorectal neoplasm; EIF5A2; 5-Fu; chemoresistance

R735.3

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.011

2014-08-07

范永胂（1980-），男，浙江杭州人，主治醫師，碩士。