姜黃素通過下調p-NF-κB表達減輕大鼠帶狀皰疹神經痛

皮治兵，申邦利，蔡振，徐旭仲，林海

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 疼痛科，浙江 溫州 325027）

·基 礎 研 究·

姜黃素通過下調p-NF-κB表達減輕大鼠帶狀皰疹神經痛

皮治兵1，申邦利2，蔡振1，徐旭仲1，林海1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 疼痛科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察姜黃素對大鼠帶狀皰疹神經痛動物模型行為學及脊髓背角和背根神經節(jié)（DRG）的磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）的影響，探討姜黃素用于帶狀皰疹神經痛治療的療效及其機制。方法：選取雄性SD大鼠80只，隨機分為4組（各20只）：C組、D組、Dcur1組、Dcur2組。C組：后爪注射0.9%氯化鈉溶液；D組：將單純皰疹病毒-1（HSV-1）接種于大鼠后爪，5 d后行0.9%氯化鈉溶液腹腔注射治療。Dcur1組、Dcur2組：HSV-1接種大鼠5 d后行腹腔內姜黃素注射治療，劑量分別為100 mg/kg、200 mg/kg。于造模前、造模后5 d（治療前）、治療結束后1、7、14 d，測定機械縮足閾值（MWT）、熱縮足潛伏期（TWL）；于治療結束后14 d檢測脊髓和DRG中p-NF-κB表達。結果：大鼠感染HSV-1后MWT從43.8降低到15.0，TWL從10.2降低到6.7，脊髓背角p-NF-κB表達從1.3增加到26.1，DRG中p-NF-κB表達從0.7增加到12.1。2組大鼠注射姜黃素后的MWT和TWL均明顯增加，而p-NF-κB的表達均明顯降低（Dcur1組脊髓背角和DRG分別降低到5.7和4.8，Dcur2組脊髓背角和DRG分別降低到3.1和2.0）。結論：姜黃素早期注射能明顯緩解帶狀皰疹神經痛，其機制與下調脊髓背角和DRG的p-NF-κB過表達有關。

帶狀皰疹神經痛；姜黃素；磷酸化核因子-κB；大鼠

帶狀皰疹神經痛是指帶狀皰疹皮疹治愈后，仍殘留的持續(xù)性、長期的疼痛，是一種頑固性的神經病理性疼痛[1]，發(fā)病率高（9%～13%帶狀皰疹患者可出現(xiàn)帶狀皰疹神經痛，60歲以上患者帶狀皰疹神經痛發(fā)病率可高達50%～75%[2]），持續(xù)時間長，嚴重影響患者的生活質量，目前治療藥物主要有加巴噴丁等，但療效及安全性尚值得評估[3-4]。姜黃為姜科植物姜黃的干燥根莖，中醫(yī)認為其有破血行氣、通經止痛的功效，而姜黃素作為姜黃的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化等多種藥理作用。本研究擬探討姜黃素對大鼠帶狀皰疹神經痛的影響及其可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 雄性SD大鼠80只，體質量200～230 g，由溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證：SCXK（浙）2010-0054，實驗動物使用許可證：SYXK（浙）2010-0058。將80只大鼠隨機分為4組（n=20）：C組：后爪注射0.9%氯化鈉溶液；D組：后爪注射單純皰疹病毒-1（HSV-1），5 d后腹腔注射0.9%氯化鈉溶液；Dcur1、Dcur2組：后爪注射HSV-1，5 d后分別腹腔注射姜黃素（批號：2142805，Sigma公司，美國，溶媒二甲基亞砜，配置成含姜黃素40 mg/mL的溶液備用）100、200 mg/（kg·d），每天1次，連續(xù)7 d。各組動物環(huán)境溫濕度相同，均定期給予飲水攝食。

1.2 模型復制 采用Takasaki等[5]報道的方法，從-80 ℃冰箱中取出凍存的HSV-1株（批號：2013145，拜奧維克斯有限公司，英國），在流動的自來水中迅速融化，取病毒懸液（濃度為106/100 μL，注射容積50 μL）接種于大鼠后爪。5 d后引起帶狀皰疹樣皮疹（玫瑰型疹子或透亮水皰）和疼痛相關反應（觸痛異常和機械性痛覺過敏）。造模后5 d的痛閾值降低到基礎值85%以下者進入下一步實驗，否則將此動物剔除（造模的60只大鼠中，D組剔除8例，1例未出疹，2例無疼痛相關反應，5例可能因皰疹伴發(fā)嚴重感染而死亡；Dcur1組剔除6例，其中3例未出疹，3例可能因皰疹伴發(fā)嚴重感染而死亡；Dcur2組剔除6例，因1例未出疹，2例疼痛閾值無明顯變化，3例可能因皰疹伴發(fā)嚴重感染而死亡。造模成功率為66.7%。實驗動物剔除后根據隨機數字表補充相應數目的動物到各組繼續(xù)實驗。

1.3 觀察指標 所有組別造模前1 d，造模后5 d，治療后1、7、14 d測定機械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）和熱縮足潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL）。MWT的測定：用IITC-2390型Electronic Von Frey觸覺測痛儀垂直刺激大鼠雙后趾，單次刺激時間≤1 s，刺激間隔10 s。記錄測試時大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為時的刺激強度值，測5次取平均值即為其MWT。TWL的測定：用IITC336甩尾足底測試儀于上述各時點測定TWL。將大鼠置于3 mm厚的玻璃板上，使用熱輻射照射其后趾相應部位，記錄從照射到縮爪回避的時間，每只大鼠雙足各測5次，每次間隔5 min，取后3次的平均值即為其TWL。

各組于治療后14 d時取7只大鼠，取L4～5節(jié)段脊髓背角和背根神經節(jié)（dosal root ganglion，DRG），石蠟包埋切片，片厚4 μm，晾干。采用SP法免疫組織化學染色測定磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）表達情況。兔抗p-NF-κB抗體購自美國Cell Signal公司，使用Nikon E-800型熒光顯微照相系統(tǒng)采集圖像。每只動物脊髓和DRG切片每隔5張順序取1張，計數脊髓背角I、 II層Lissauer區(qū)和DRG中間區(qū)p-NF-κB的陽性細胞數。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析。所有計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗；組內差異采用隨機區(qū)組設計的方差分析Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MWT的變化 與基礎值和C組相比，D組造模后5 d MWT明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。治療前D組和Dcur1組、Dcur2組MWT差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與D組相比，Dcur1、Dcur2組治療后1、7、14 d的MWT明顯升高（P＜0.05）。治療后1、7、14 d Dcur2組的MWT顯著高于Dcur1組（P＜0.05）。詳見表1。

2.2 TWL的變化 與基礎值和C組相比，D組造模后5 d TWL明顯降低（P＜0.05）。與D組比，Dcur1組、Dcur2組在治療前和治療后1 d TWL差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而治療后7、14 d Dcur1組、Dcur2組的TWL均高于D組（P＜0.05）。治療后7、14 d Dcur2組的TWL高于Dcur1組（P＜0.05），見表2。

2.3 p-NF-κB表達的變化 與C組比，D組大鼠脊髓背角和DRG中的p-NF-κB的表達均明顯增加（P＜0.05）。與D組比，Dcur1組和Dcur2組p-NF-κB的表達均顯著減少（P＜0.05）。Dcur2組p-NF-κB表達低于Dcur1組（P＜0.05）。見表3和圖1-4。

表1 姜黃素對MWT的影響（n=20，，Gr）

表1 姜黃素對MWT的影響（n=20，，Gr）

與D組基礎值比：aP＜0.05；與C組比：bP＜0.05；與造模后5 d比：cP＜0.05；與D組比：dP＜0.05；與Dcur1組比：eP＜0.05

組別基礎值造模后5 d治療后1 d7 d14 d C組42.0±1.342.2±1.5ba42.6±1.6aba41.6±1.1aba41.3±1.3abaD組43.8±1.015.0±0.8ab16.9±0.9aba17.4±0.8aba18.1±0.6abaDcur1組44.1±0.815.1±0.7ba18.3±0.8cda26.1±0.5cda36.5±0.4cdaDcur2組45.3±1.215.3±0.8ba24.2±0.4cde35.3±0.4cde42.1±0.6cde

表2 姜黃素對TWL的影響（n=20，，s）

表2 姜黃素對TWL的影響（n=20，，s）

與D組基礎值比：aP＜0.05；與C組比：bP＜0.05；與造模后5 d比：cP＜0.05；與D組比：dP＜0.05；與Dcur1組比：eP＜0.05

組別基礎值造模后5 d治療后1 d7 d14 d C組11.5±1.112.6±0.8ab11.1±1.2ab12.1±1.4eee11.4±1.3eeeD組10.2±1.2 6.7±1.5ab6.2±0.8ab6.2±1.5abe6.8±0.8abeDcur1組11.1±1.1 6.6±0.9ab6.1±0.8ab7.0±0.8cde8.1±0.5cdeDcur2組11.6±2.1 6.7±0.6ab6.3±0.8ab8.0±0.7cde9.4±0.7cde

表3 姜黃素對p-NF-κB表達的影響（n=7，）

表3 姜黃素對p-NF-κB表達的影響（n=7，）

與C組比：aP＜0.05；與D組比：bP＜0.05；與Dcur1組比：cP＜0.05

組別 脊髓背角 DRG C組 1.3±0.2 0.7±0.2 D組26.1±1.1a12.1±1.0aDcur1組 5.7±1.2b4.8±0.7bDcur2組 3.1±0.7bc2.0±0.3bc

3 討論

圖1 C組p-NF-κB表達（SP，×200）

圖2 D組p-NF-κB表達（SP，×200）

圖3 Dcur1組p-NF-κB表達（SP，×200）

圖4 Dcur2組p-NF-κB表達（SP，×200）

帶狀皰疹神經痛是帶狀皰疹感染皮區(qū)的持續(xù)性疼痛，急性期是由于水痘-帶狀皰疹病毒感染了感覺神經節(jié)和其分布的皮區(qū)，引起神經分布皮區(qū)的感染性疼痛，慢性期可有較明顯的痛覺過敏及異常性疼痛，這可能與中樞的神經元細胞鈉離子電流密度增加有關[6]。亦有研究者認為包括帶狀皰疹神經痛在內的神經病理性疼痛的特征是中樞神經系統(tǒng)的損害區(qū)域神經元興奮性過高，這過高的興奮性是由于外周傷害性感受器、DRG、脊髓后角和腦等多個水平的分子變化所造成的[2]。本研究也得出了類似的結果，感染了帶狀皰疹的大鼠其脊髓背角和DRG神經元p-NF-κB產生了過度表達。NF-κB是廣泛存在于各種細胞胞漿中的一種轉錄因子，被活化時可激活并誘導其下游因子環(huán)氧化酶2（COX2）的表達，從而使脊髓背角和DRG神經元中重要的致痛物質—前列腺素E2（PGE2）的水平升高。這部分解釋了感染了帶狀皰疹的大鼠為什么表現(xiàn)為痛覺過敏（MWT和TWL均降低）。

姜黃素是一種傳統(tǒng)的中醫(yī)藥，藥理作用廣泛，具有抗炎、抗氧化、抗纖維化、抗癌、活血鎮(zhèn)痛作用。有研究證明姜黃素能通過下調TNF-α和NF-κB表達而產生抗糖尿病性神經痛作用[7-9]，或通過抑制TRPV1通道而產生抗神經病理性疼痛作用[10]。亦有研究證明姜黃素能增加大鼠海馬的神經發(fā)生和神經可塑性及神經修復[11]。帶狀皰疹后遺神經痛可能與外周、脊髓及中樞等部位神經細胞炎性反應和神經細胞凋亡有關，亦與皰疹病毒神經破壞有關[12]，這提示姜黃素對帶狀皰疹后遺神經痛可能有效。本實驗中給予帶狀皰疹大鼠（據Takasaki等[5]報道，小鼠接種HSV-1 5 d后進入帶狀皰疹急性期，出現(xiàn)疼痛和皰疹。15 d后皮膚病損完全愈合，大約有一半的小鼠相當長的一段時間內存在疼痛相關反應，即慢性期—帶狀皰疹后遺神經痛）不同劑量的姜黃素2周，機械和熱痛敏均顯著減輕，且200 mg姜黃素作用較100 mg姜黃素治療作用強，這與我們早前的研究[13]結果一致。而且?guī)畎捳钌窠浲创笫蠹顾璞辰呛虳RG中過度表達的p-NF-κB被姜黃素顯著抑制，此抑制作用與其減輕機械和熱痛敏作用平行，這提示姜黃素減輕帶狀皰疹神經痛作用可能與下調脊髓背角和背根神經元中p-NF-κB的過表達有關。

綜上所述，姜黃素對實驗大鼠帶狀皰疹神經痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，其機制可能與姜黃素抑制脊髓p-NF-κB過表達有關。姜黃素藥理作用廣泛，是否存在其他機制尚待進一步研究。

[1] Hempenstall K, Nurmikko TJ, Johnson RW, et al. Analgesic therapy in postherpetic neuralgia: a quantitative systematic review[J]. PLoS Med, 2005, 2(7): e164.

[2] Odom RB, Berger TG, James WD. Andrews’diseases of skin[M]. 9th. Beijing:Science Press, 2001: 473-476.

[3] Pickering G. Antiepiletics for postherpetic neuralgia in the elderly; current and future prospects[J]. Drugs Aging, 2014, 31(9): 653-660.

[4] Fan H, Yu W, Zhang Q, et al. Efficacy and safety of gabapentin 1800 mg treatment for post-herpetic neuralgia: a meta-analysis of randomized controlled trials[J]. J Clin Pharm Ther, 2014, 39(4): 334-342.

[5] Takasaki I, Sasaki A, Andoh T, et al. Effects of analgestics on delayed postherpetic pain in mice[J]. Anesthesiology, 2002, 96(5): 1168-1174.

[6] Kennedy PG, Montague P, Scott F, et al. Varicella-zoster viruses associated with post-Herpetic neuralgia induce sodium current density increases in the ND7-23 Nav-1.8 neuroblastoma cell line[J]. PLoS One, 2013, 8(1): e51570.

[7] Li Y, Zhang Y, Liu DB, et al. Curcumin attenuates diabetic neuropathic pain by downregulating TNF-α in a rat model [J]. Int J Med Sci, 2013, 10(4): 377-381.

[8] Nishida M, Nishiumi S, Mizushina Y, et al. Monoacetylcurcumin strongly regulates inflammatory responses through inhibition of NF-kappaB activation[J]. Int J Mol Med, 2010, 25(5): 761-767.

[9] Huang G, Yang Y, Xu Z, et al. Down regulation of B lymphocyte stimulator expression by curcumin in B lymphocyte via suppressing nuclear translocation of NF-kappaB[J]. Eur J Pharmacol, 2011, 650(1): 451-457.

[10] Lee JY, Shin TJ, Choi JM, et al. Antinociceptive curcuminoid, KMS4034, effects on inflammatory and neuropathic pain likely via modulating TRPV1 in mice[J]. Br J Anaesth, 2013, 111(4): 667-672.

[11] 楊麗娟, 董軍, 陸大祥, 等. 姜黃素對LPS激活小膠質細胞條件培養(yǎng)基誘導損傷的海馬神經元保護作用及機制[J].中國病理生理雜志, 2010, 26(4): 742-747.

[12] Gilron I, Watson CP, Cahill CM, et a1. Neuropathic pain: a practical guide for the clinician[J]. CMAJ, 2006, 175(3): 265-275.

[13] 申幫利, 余相地, 曹紅, 等. 姜黃素對大鼠糖尿病神經病理性痛的效應[J]. 中華麻醉學雜志, 2009, 29(7): 626-629.

（本文編輯：丁敏嬌）

Curcumine attenuates herpetic neuralgia by down-regulated expression of p-NF-κB in a rat model

PI Zhibing1, SHEN Bangli2, CAI Zhen1, XU Xuzhong1, LIN Hai1. 1.Department of Anesthesiology, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Pain, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To evaluate the effect of curcumin on herpetic neuralgia in rats and its mechanisms. Methods: Sixty rats with therpetic neuralgia induced by claw injection of HSV-1 and 20 healthy control (C group) rats whose claw were injected by normal saline were included. Twenty rats which had been injected HSV-1 were injected in intraperitoneal 100 mg/kg curcumin 5 days later (Dcur1 group), and 20 rats were injected 200 mg/kg curcumin (Dcur2 group), and the rest 20 rats were injected normal saline (D group ). We tested mechanical allodynia with electronic von frey and tested thermal hyperalgesia with radiant heat before HSV-1 injection, 5 days later after HSV-1 injection, on 1, 7, 14 days after curcumin or NS injection. p-NF-κB in lumbar spinal cord (L4～5) and DRG was estimated by immunohistochemistry at 14 d after NS or curcumine was given. Results: Compared to C group, Shingles rats exhibited significant pain hypersensitivity, as evidenced by decreased paw withdrawal threshold to electronic von Frey and decreased paw withdrawal latency to heat. After herpes infection, rat’s mechanical paw withdrawal threshold reduced from 43.8 to 15.0, and thermal withdrawal latencies reduced from 10.2 to 6.7. Phosphorylation of nuclear factor (p-NF)-κB expression in the spinal cord dorsal horn increased from 1.3 to 26.1, while phosphorylation of nuclear factor (p-NF)-κB expression in the dorsal root ganglion increased from 0.7 to 12.1. However, curcumine significantly attenuated the Shingles-induced allodynia and hyperalgesia and reduced the expression of p-NF-κB (Dcur1 spinal cord dorsal horn/dorsal root ganglion reduced to 5.7/4.8, Dcur2 spinal cord dorsal horn/dorsal root ganglion reduced to 3.1/2.0). Conclusion: Curcumine seems attenuate pain threshold in herpetic neuralgia rats, possibly through an inhibitory action on p-NF-κB expression in spinal dorsal horn and dorsal root ganglion.

herpetic neuralgia; curcumine; p-NF-κB; rats

R373.1

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.010

2014-12-29

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺骨干人才計劃項目（2011RCB026）。

皮治兵（1977-），男，湖北通城人，主治醫(yī)師，碩士。

林海，副教授，碩士生導師，Email：422133061@qq.com。