沉默黏著斑激酶表達抑制大腸癌轉移的體內研究

洪衛文，蘇國強，應紅安，林峰，梁衛東

（1.臺州市第一人民醫院 普外科，浙江 臺州 318020；2.廈門大學附屬第一醫院 普外科，福建 廈門361000；3.臺州市第一人民醫院 特需VIP科，浙江 臺州 318020）

·論 著·

沉默黏著斑激酶表達抑制大腸癌轉移的體內研究

洪衛文1，蘇國強2，應紅安3，林峰1，梁衛東1

（1.臺州市第一人民醫院 普外科，浙江 臺州 318020；2.廈門大學附屬第一醫院 普外科，福建 廈門361000；3.臺州市第一人民醫院 特需VIP科，浙江 臺州 318020）

目的：通過裸鼠實驗研究，證實沉默黏著斑激酶（FAK）的表達能有效抑制大腸癌的轉移。方法：將24只裸鼠隨機分成3組：實驗組、陰性對照組、未處理組，分別注射FAK穩定沉默的結腸癌細胞、陰性對照組的結腸癌細胞、未特殊處理的結腸癌細胞，每組各8只裸鼠。在SPF條件動物實驗室飼養6周后處死裸鼠，觀察原位成瘤率、病死率、瘤體生長、肝肺轉移情況，通過HE染色、免疫組織化學染色研究FAK微轉移灶、蛋白表達情況。結果：各組成瘤率均為100%。與陰性對照組及未處理組相比，實驗組轉移率、病死率和FAK蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且轉移灶惡變程度更低、形態更好，而陰性對照組與未處理組差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：通過shRNA介導的FAK基因沉默對SW620原位移植后的裸鼠肝肺轉移有明顯抑制，FAK有望成為治療大腸癌轉移的新靶點。

黏著斑激酶；SW620；大腸腫瘤；裸鼠；轉移

大腸癌是常見的惡性腫瘤，包括結腸癌和直腸癌，是西方國家的第二大惡性腫瘤，中國第三大惡性腫瘤，發病率逐年升高。每年約有50%的腸癌患者發生腫瘤轉移。即使少數患者能早期發現，并予積極的手術治療和化療，其中仍有19%發生轉移，5年生存率只有63%，而很多患者一經確診已為晚期，5年生存率都不到10%[1-5]。大腸癌患者的主要死因在于腫瘤轉移，近年來，各種靶向藥物如貝伐單抗、西妥昔單抗和帕尼單抗等通過抑制腫瘤細胞的信號轉導、黏附、遷移等途徑抑制腫瘤轉移，取得較好療效[4]。而黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）介導的信號轉導系統是最重要的腫瘤細胞信號轉導途徑之一。

本課題組前期體外實驗研究已成功構建穩定FAK沉默的細胞株，并通過RT-PCR及Western blot技術證實FAK沉默能有效抑制人源結腸癌株SW620的增殖及侵襲[5]。為探討其體內抑癌作用，本研究建立裸鼠盲腸原位移植癌模型，進一步研究shRNA（short hairpin RNA，短發夾RNA）沉默FAK基因表達對大腸癌侵襲轉移的體內作用，該模型能很好地模擬人大腸癌的生物學行為，是研究大腸癌轉移、治療的理想動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級6周齡、體質量18～20 g雌性裸鼠24只購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 主要儀器和試劑 倒置顯微鏡（日本Olympus公司），質粒小抽試劑盒（美國Qiangen公司），新生小牛血清、DMEM、Polybrene、G418、NEAA、RMPI 1640（美國Gibco公司），氨芐青霉素、TEMED（美國Sigma公司），TurboFect（美國Fermentas公司），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美國Millipore公司），Tris（美國Boehringer Mannheim公司），羊抗鼠二抗（武漢博士德生物公司），FAK抗體一抗（上海吉凱公司），二抗（廈門鷺隆生物科技發展有限公司），免疫組織化學試劑盒（福州邁新生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 穩定FAK沉默結腸癌細胞株SW620的建立：本課題組前期體外實驗研究將已構建好插入FAK shRNA的慢病毒載體pLL3.7及插入無意義片段的陰性對照慢病毒載體pLL3.7，分別感染SW620結腸癌細胞，使用熒光倒置顯微鏡檢測證實感染率＞90%，成功構建穩定FAK沉默的細胞株，并通過RT-PCR及Western blot技術檢測證實了實驗組FAK mRNA及蛋白質的表達較陰性對照組顯著下降，差異有統計學意義，FAK沉默能抑制人源結腸癌株SW620的增殖及侵襲[6]。

1.3.2 實驗分組：將24只雌性裸鼠隨機分成3組，即實驗組、陰性對照組、未處理組，每組8只，在廈門大學抗癌研究中心動物實驗室SPF條件下飼養，1周后接種，調整細胞密度至1×108，實驗組于盲腸接種攜帶shRNA的FAK基因沉默的SW620細胞株；陰性對照組于盲腸接種攜帶陰性對照慢病毒載體的SW620細胞株；未處理組于盲腸注射未處理的SW620細胞株。

1.3.3 裸鼠接種、飼養觀察及取材：取左下腹1 cm切口，逐層分離挑出小鼠盲腸，實驗組、陰性對照組、未處理組各組接種相應的SW620細胞懸液0.1 mL至漿膜層，接種過程中實驗組裸鼠死亡1只。接種后繼續于SPF條件下動物實驗室飼養，每天觀察裸鼠的活動能力、進食情況、體質量、腹部觸診情況等。飼養6周后處死裸鼠，各實驗組取盲腸、肺臟、肝臟行免疫組織化學、HE染色，以下實驗均在廈門大學抗癌研究中心動物實驗室完成。

1.3.4 HE染色、免疫組織化學染色：組織標本取材后常規固定、包埋、洗滌、脫水、透明、浸蠟與包埋、7 μm切片、貼片，將載玻片放入60 ℃恒溫箱中烘烤2 h后，進行常規HE染色，免疫組織化學步驟參照邁新SP試劑盒說明書進行。免疫組織化學結果判定：利用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統軟件測定每張照片中陽性區域的累積光密度（integrated optical density，IOD），取每張切片的5個視野所得IOD的平均值進行檢測指標的半定量分析，IOD能反映選定區域的蛋白表達總量。

1.4 統計學處理方法 本研究采用隨機對照設計。應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。數據用表示，樣本均數間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 裸鼠死亡及原位成瘤率 注射結腸癌細胞6周后，實驗組未出現死亡，體質量及狀態均好于其他兩組，陰性對照組死亡2只，未處理組死亡2只，均有消瘦、進食差。死亡裸鼠的原因考慮與感染、腫瘤生長等有關。各組成瘤率均為100%，大體標本表明各組盲腸均可見成瘤，大小數量不一，色稍白，呈圓形隆起（如圖1箭頭所示）。實驗組較其他兩組腫瘤體積更小，數量更少，盲腸形態更好，病理證實為接種的SW620癌細胞（見圖1）。

2.2 各組盲腸、肝臟、肺臟轉移及HE染色、免疫組織化學染色結果

2.2.1 各組盲腸、肝肺轉移情況：實驗組7只裸鼠1只肝轉移，轉移腫瘤結節小，且數量少，陰性對照組8只裸鼠死亡2只，存活的6只中4只發現肝轉移，轉移灶彌漫，未處理組8只裸鼠死亡2只，余6只裸鼠均發現肝多發轉移。死亡裸鼠極度消瘦，呈惡液質，并有腹水，解剖肝臟糜爛，表面呈粗糙顆粒狀，病理證實為腫瘤轉移，肺部呈實變。肝臟轉移率分別為：實驗組14.29%，陰性對照組75.00%，未處理組100.00%，與陰性對照組及未處理組相比，實驗組轉移率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），陰性對照組與未處理組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。各組均未發生肺轉移，肉眼均未見明顯腫瘤結節，顏色較光澤，外觀無明顯差異（見圖2）。

圖1 各組盲腸原位腫瘤

圖2 各組裸鼠肝臟

2.2.2 HE染色結果：各組盲腸HE染色顯示滿視野結腸癌細胞，細胞及組織極性紊亂，分化差，可見SW620細胞懸液注射到盲腸漿膜層后可成功成瘤。實驗組腫瘤與正常腸管組織界限分明，而陰性對照組及未處理組中形成的腫瘤包塊浸潤周圍組織，界限不清。各組肝臟HE染色結果顯示實驗組腫瘤較局限，界限較分明，周圍肝臟組織完好，而陰性對照組及未處理組中形成的腫瘤包塊浸潤周圍組織，界限不清。各組肺臟HE染色顯示實驗組肺臟形態較好，而陰性對照組和未處理組肺臟含大量紅細胞（見圖3）。

圖3 各組腫瘤HE染色圖片（×400）

2.2.3 免疫組織化學染色結果：FAK蛋白表達為棕色顆粒，箭頭所示為轉移灶，結果顯示盲腸實驗組、陰性對照組及未處理組IOD（×106）值分別為2.67± 0.60、4.89±0.55、5.12±0.36，實驗組肝組織壞死明顯少于陰性對照組和未處理組，肝臟實驗組、陰性對照組及未處理組IOD（×106）值分別為1.96±0.39，2.73±0.16，2.80±0.21。盲腸及肝臟的實驗組與陰性對照組及未處理組相比差異均有統計學意義（P＜0.05），陰性對照組與未處理組相比差別均無統計學意義（P＞0.05）。免疫組織化學染色結果顯示實驗組FAK蛋白表達明顯降低，可見實驗組腫瘤細胞在裸鼠體內生長時仍可穩定沉默FAK表達（見圖4-5）。

圖4 各組腫瘤免疫組織化學染色圖片（×400）

圖5 各組FAK蛋白質表達條圖

3 討論

目前國內外大量研究表明FAK在很多惡性腫瘤如腸癌、肺癌、前列腺癌、子宮附件惡性腫瘤中都過度表達[6-8]；FAK參與腫瘤細胞的增殖、抑制細胞的凋亡以及促進腫瘤細胞的黏附、遷移等。諸多研究已證實在大腸癌組織中，FAK在原發癌及肝轉移癌中均較正常大腸黏膜表達增高；腸腺瘤伴不典型增生組織中較正常大腸黏膜表達率高[9]。FAK可能的調節通路包括增強Ras基因的活化，影響MAPK的級聯激活，ERK活化后轉位到細胞核內后使部分轉錄調控因子磷酸化，最終使細胞生長增強；同時，FAK下調CAS凋亡蛋白酶的表達，降低JNK、MMPs基因活性，使癌細胞凋亡減少，逐漸獲得侵襲能力[10]。文獻報道細胞實驗證實抑制FAK的表達可有效地降低腫瘤細胞的黏附和侵襲[11-13]，可見，如人為降低FAK蛋白的表達水平，可能有望控制腫瘤的轉移及擴散。

本研究建立在前期實驗的基礎上，利用RNAi技術，通過穩定轉染SW620結腸癌細胞，達到抑制結腸癌細胞FAK蛋白的表達，為大腸癌體內轉移實驗奠定基礎。本研究采用原位移植腫瘤方法，真實模擬SW620結腸癌細胞在體內發生轉移的生物學特征，研究FAK基因的沉默對SW620結腸癌細胞的轉移的影響。實驗挑取干擾效果好，生長旺盛的FAK抑制的單克隆細胞株，擴增培養，作為體內實驗的實驗組細胞，與陰性對照組和未處理組細胞分別異種移植到裸鼠。本研究建立原位盲腸移植動物模型，為大腸癌靶向基因治療提供一新的方法，在腫瘤轉移環節上給予干預或設法阻斷，將大大提高臨床療效。臨床研究表明，晚期大腸癌患者中20%～30%發生肝臟轉移[14]，10%～15%發生腹膜轉移，10%～25%發生肺臟轉移[15]，而結直腸以外的部位者較少發生轉移。本課題研究SW620結腸癌細胞的轉移實驗中，6周后處死裸鼠，取盲腸、肝臟、肺臟染色發現實驗組裸鼠肝臟轉移明顯少于陰性對照組和未處理組，陰性對照組和未處理組差異無統計學意義，肝轉移實驗結果與體外實驗相一致；各組均未見肺部轉移情況。可能原因考慮為回盲部靜脈回流至腸系膜上靜脈后直接進入肝臟，容易早期發生肝臟的轉移，也可能在實際回盲部種植結腸癌細胞時已破壞局部毛細血管，部分腫瘤細胞直接進入腸系膜上靜脈，使得很早期即能發現肝臟轉移灶，而發生肺部轉移時腫瘤細胞必須從生長部位脫落后進入動脈血管，并在肺部定植后才能生長，可能需要較長的時間，在實際裸鼠飼養過程中，6周后裸鼠的病死率明顯上升，長時間飼養裸鼠很難實現，此外腫瘤細胞本身對靶器官的親和力可能也決定了容易發生肝臟轉移；在肝轉移的情況中，可知沉默FAK后的SW620結腸癌細胞轉移實驗組明顯低于陰性對照組和未處理組，且轉移臟器的形態、病理更好，進一步提示FAK在腫瘤轉移中起著重要作用。

綜上所述，本研究利用構建好的pLentilox3.7 FAK慢病毒載體在293FT細胞中包裝成慢病毒，通過感染結腸癌細胞SW620建立穩定FAK沉默的細胞株，將細胞懸液異體移植到裸鼠體內，并測量腫瘤生長及裸鼠肝轉移情況，在體內證實下調SW620結腸癌細胞FAK的表達，阻斷了以FAK為主的信號傳導通路，能有效抑制SW620的侵襲能力，為以后臨床靶向治療大腸癌提供了一種新的思路和方法。

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（本文編輯：吳健敏）

The effect of silenced focal adhesion kinase on colorectal cancer metastasis in vivo

HONG Weiwen1, SUGuoqiang2, YING Hongan3, LIN Feng1, LIANG Weidong1. 1.Department of General Surgery, the First People’s Hospital of Taizhou, Taizhou, 318020; 2.Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen, 361000; 3.Special Service Ward, the First People’s Hospital of Taizhou, Taizhou, 318020

Objective: Focal adhesion kinase gene silencing by Short Hairpin RNA can effectively inhibit colorectal cancer’s metastasis were confirmed through injection of FAK-knockdown colorectal cancer cells into nude mice. Methods: Twenty-four nude mice were randomly divided into three groups which were experimental group which inject FAK-knockdown colon cancer cells, negative control group whick inject negative control colon cancer cells and untreated group which inject untreated colon cancer cells. Nude mice were sacrificed after 6 weeks and tumor formation rate, mortality, tumor growth, liver and lung’s metastasis, miscrometastasis were observed and FAK protein expression were determined with HE staining and immunohistochemical staining. Results: Tumor formation rate was 100% in each group. Distant metastases, mortality and FAK protein expression of experimental group was significantly lower than that of the other two groups (P＜0.05), meanwhile, the malignant lesion extent was lighter. While negative control group and untreated group were not significantly different (P＞0.05). Conclusion: Lentiviral packaging shRNA-mediated FAK gene silencing can significantly inhibit liver and lung metastasis of colorectal cancer. FAK is expected to be a new target for treatment of colon cancer metastasis.

focal adhesion kinase; SW620; colorectal neoplasms; nude mouse; metastasis

R735.35

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.007

2014-02-18

洪衛文（1983-），男，福建龍巖人，住院醫師，碩士。