Notch 1信號通路蛋白在不同程度顱腦損傷大鼠中的表達(dá)

王偉，高志超，朱鵬磊，鄭偉明，涂明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

Notch 1信號通路蛋白在不同程度顱腦損傷大鼠中的表達(dá)

王偉，高志超，朱鵬磊，鄭偉明，涂明

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，浙江 溫州 325015）

目的：通過檢測Notch 1信號通路的下游表達(dá)物Jagged 1、Hes 1在輕、中、重三種閉合性顱腦損傷（TBI）大鼠中的表達(dá)情況，探討Notch 1信號通路在顱腦損傷中的作用。方法：利用液壓沖擊法模擬大鼠輕、中、重三種閉合性TBI模型；通過神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度評分（NSS）評估24 h后各組大鼠神經(jīng)功能缺失情況；免疫組織化學(xué)及蛋白印跡方法檢測三型TBI后腦皮質(zhì)Notch 1信號通路下游表達(dá)因子Jagged 1及Hes 1的表達(dá)情況。結(jié)果：輕、中、重3組TBI模型中，NSS評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），造成的腦損傷越重，神經(jīng)功能缺失情況越明顯，說明模型建立成功；免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測結(jié)果顯示輕、中、重三型TBI組的Hes 1和Jagged 1的表達(dá)水平均較對照組明顯增高（P＜0.05），且隨著TBI程度的增高，該通路蛋白的表達(dá)量也在增加。結(jié)論：Notch 1信號通路可能參與了TBI的發(fā)展過程，可能成為TBI后治療的新靶點。

顱腦損傷；液壓沖擊法；Notch 1信號通路

我國顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的人群年發(fā)生率已超過100/10萬人口[1-2]，而在美國TBI的發(fā)病率居所有創(chuàng)傷的首位，占全身各部位創(chuàng)傷的9%～21%[3]。雖然隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，創(chuàng)傷性腦損傷患者的治療得到了很大的提高，但仍不能有效地降低腦損傷患者的病死率和致殘率，患者預(yù)后不佳[4]。尋找一種新的有效的臨床治療途徑顯得十分重要。Notch通路是存在于許多動物體內(nèi)的一條高度保守的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。多項研究發(fā)現(xiàn)Notch通路的突變或與通路有關(guān)的某些蛋白分子的變異都會導(dǎo)致人類某些疾病的發(fā)生[5]。有些更是罕見的遺傳性疾病，而在許多癌癥中Notch信號通路的異常更常見[6]。近年來，信號通路的靶向治療已漸漸成為人們研究的熱點，其中對Notch信號通路的研究最為深入，被認(rèn)為是未來許多疾病新的治療靶點。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)TBI后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）的蛋白標(biāo)記物包括PSANCAM、SOX2和NeuroD等的表達(dá)以及增殖性NSCs的數(shù)量較正常腦組織明顯增加[7]，而Notch 1信號通路被認(rèn)為是NSCs激活、增殖及分化行為最重要的調(diào)節(jié)器之一[8]，并且Notch 1信號通路可以誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞繼續(xù)增殖或向神經(jīng)元分化[9]，但是該通路是否同時也參與了TBI的發(fā)展過程，目前尚不明確。本研究通過液壓沖擊（lateral fluid percussion，LFP）法[10]建立不同程度閉合性TBI動物模型，通過觀察TBI后Notch 1信號通路的下游表達(dá)物Hes 1、Jagged 1的表達(dá)水平來探討該通路是否參與了TBI的發(fā)展過程，試圖尋找TBI治療的新靶點。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 羊抗鼠Jagged 1抗體（美國Abcam公司），兔抗鼠Hes 1抗體（美國Abcam公司），兔抗羊IgG抗體、驢抗羊IgG抗體（美國Jackson公司）等。低溫高速離心機(jī)（美國Thermo公司），腦立體定位儀（美國Stoelting公司），液壓打擊儀等。

1.2 不同程度TBI大鼠模型建立方法 實驗動物從上海市實驗動物中心和溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心購買，所有的實驗操作及飼養(yǎng)均按照溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理飼養(yǎng)條例進(jìn)行。取健康雄性SD大鼠（250～300 g）80只，隨機(jī)分為對照組20只、手術(shù)組60只，手術(shù)組又分為輕型、中型和重型TBI組，每組20只。10%水合氯醛（0.3 mL/100 g體質(zhì)量）腹腔內(nèi)注射麻醉手術(shù)組大鼠，將其頭部固定于腦立體定向儀上，取仰臥位，備皮消毒后，用牙科鉆在無菌條件下行一側(cè)頂葉顱骨切開術(shù)（中線旁3.5 mm，前囟后2.5 mm，直徑為5 mm的小骨窗，硬膜保持完整），連接液壓打擊儀，調(diào)節(jié)不同打擊力度（注意實驗全程保證硬腦膜完整），分別選擇2.10～3.10 atm，3.10～4.10 atm，4.10～5.00 atm三種壓力打擊大鼠，形成輕、中、重度TBI，術(shù)后縫合頭皮。對照組不做任何處理，術(shù)后所有大鼠置鼠籠喂養(yǎng)，房間溫度維持在（37±0.5）℃。術(shù)后24 h對手術(shù)組和對照組大鼠行神經(jīng)系統(tǒng)疾病嚴(yán)重程度評分（neurological severity scores，NSS），根據(jù)提起大鼠的尾部，看雙側(cè)前肢是否彎曲及頭上仰高度、感覺測試、反射和異常活動以及平衡木實驗多項指標(biāo)評分（共計18分），無法完成其中一項或其中一項缺失給予1分，其中1～6分為輕度神經(jīng)功能缺損，7～12分為中度神經(jīng)功能缺損，13～18分為重度神經(jīng)功能缺損。取腦做腦皮質(zhì)HE染色，鏡下觀察。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測 按照試劑盒說明書采用免疫組織化學(xué)二步法檢測Notch 1信號通路下游蛋白Jagged 1和Hes 1的表達(dá)情況，其中一抗分別為：羊抗鼠Jagged 1多克隆抗體（1∶500），兔抗鼠Hes 1單克隆抗體（1∶500）；二抗分別為兔抗羊IgG抗體、驢抗羊IgG抗體；同時以PBS代替一抗作為陰性對照，觀察并拍照。采用雙盲法閱片，胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，即Jagged 1（+），Hes 1（+）。在光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取10個視野（×400倍）采集圖像，應(yīng)用Image-Pro Plus軟件選取并分析陽性區(qū)域，計算積分密度值（IOD）來反映陽性蛋白的強(qiáng)度或濃度。

1.4 Western blot法檢測 切取大鼠TBI周圍組織勻漿，取上清液與等體積2×上樣緩沖液混合形成上樣液。蛋白（50 μg）100 ℃沸水中煮沸5 min，SDS/12%聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠劑中電泳，再轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。然后在4 ℃下用以下一抗孵化過夜（Jagged 1 1∶3 000，Hes 1 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000），二抗（1∶2 000）室溫孵育2 h后暗室中用X線膠片感光、顯影、定影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料用表示，若數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布且方差齊，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩均數(shù)比較用LSD-t檢驗。數(shù)據(jù)非正態(tài)分布或方差不齊，用多樣本比較的Kruskal-Wallis H秩和檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TBI大鼠模型的建立 手術(shù)組大鼠共有6只在造模過程中死亡，其中輕型TBI組死亡2只，中型TBI組死亡1只，重型TBI組死亡3只，對照組大鼠在實驗過程中無死亡。手術(shù)組大鼠傷后24 h出現(xiàn)皮質(zhì)、蛛網(wǎng)膜下腔及皮質(zhì)下白質(zhì)不同程度的出血，見圖1。手術(shù)組大鼠挫裂灶局部腦組織碎裂，中、重度TBI更伴有片狀出血，損傷灶周圍有明顯的水腫帶形成，水腫帶內(nèi)可見多數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯腫脹，部分神經(jīng)元胞核丟失，血管受壓變形，破裂出血，而正常腦皮質(zhì)部位為粉紅色。

2.2 手術(shù)組大鼠NSS評分情況 采用NSS評分量表分別對手術(shù)組各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)評分，隨著腦損傷程度的加重，大鼠神經(jīng)行為缺損越嚴(yán)重，輕、中、重型TBI組NSS評分分別為（3.30±1.16）、（9.60± 1.43）、（14.40±1.43）分，與對照組的（1.20±0.42）分比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 Notch1信號通路蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果 手術(shù)組的Jagged 1和Hes 1的表達(dá)量均大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Notch 1信號通路蛋白的表達(dá)量隨著腦損傷程度的增加而增加，手術(shù)組內(nèi)差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2-3和表1。

圖2 Jagged 1在大鼠腦皮質(zhì)中的表達(dá)（×400，箭頭所指為陽性細(xì)胞）

圖3 Hes 1在大鼠腦皮質(zhì)中的表達(dá)（×400，箭頭所指為陽性細(xì)胞）

表1 Notch 1信號通路蛋白在不同TBI組中的表達(dá)（IOD，）

表1 Notch 1信號通路蛋白在不同TBI組中的表達(dá)（IOD，）

與對照組比：aP＜0.05；與輕型TBI組比：bP＜0.05；與中型TBI組比：cP＜0.05

組別 n Jagged 1 Hes 1對照組20 409.13±105.55 297.19±91.03輕型TBI組18 791.35±513.09a481.29±197.55a中型TBI組191 498.69±1 033.81ab1 166.47±617.74ab重型TBI組177 650.20±7 066.12abc6 782.42±5 731.87abc

2.4 Notch1信號通路蛋白Western blot法檢測結(jié)果 與對照組相比，手術(shù)組的Notch 1通路蛋白表達(dá)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；手術(shù)組內(nèi)隨著腦損傷嚴(yán)重程度的增加表達(dá)量增多，組內(nèi)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖4-6。

圖4 Western blot法檢測Hes 1在大鼠腦皮質(zhì)中的表達(dá)

3 討論

圖5 Western blot法檢測Jagged 1在大鼠腦皮質(zhì)中的表達(dá)

圖6 Notch 1信號通路蛋白表達(dá)情況

本研究首先利用LFP法模擬臨床上不同程度的TBI動物模型，旨在探討Notch 1通路是否參與了TBI的發(fā)展過程。目前模擬臨床閉合性TBI模型的方法主要有3種：自由落體法、凍傷法和液壓打擊法。而本實驗建立的TBI模型基本要求是重復(fù)性好、靈敏性高，且和臨床腦損傷機(jī)制相似。我們所用的LFP法有如下優(yōu)點：①可以模擬出神經(jīng)病理學(xué)以及損傷后行為結(jié)果都可達(dá)到輕度至重度創(chuàng)傷性腦損傷，打擊力度可量化分級；②操作靈敏度高，不會發(fā)生二次腦損傷，且損傷機(jī)制與臨床上腦外傷的損傷最為相似。但仍需注意：①實驗過程中必須保證大鼠在打擊后硬腦膜的完整性，提高模型的穩(wěn)定性；②行顱骨切除術(shù)時，若大鼠骨縫中存有殘留骨屑或者骨蠟不易取出，則會影響實驗結(jié)果；③應(yīng)充分考慮到大鼠的反射恢復(fù)時間及病死率，否則需及時調(diào)整打擊力度。本實驗過程中，手術(shù)組大鼠均在術(shù)后2 h恢復(fù)反射，共有6只在造模過程中死亡，其中輕型TBI組死亡2只，中型TBI組死亡1只，重型TBI組死亡3只，對照組大鼠在實驗過程中無死亡，病死率為7.5%（6/80），打擊力度分別為輕型TBI組2.10～3.10 atm，中型TBI組3.10～4.10 atm，重型TBI組4.10～5.00 atm，均在操作的可控范圍內(nèi)。通過術(shù)后24 h對動物模型行NSS評分發(fā)現(xiàn)手術(shù)組大鼠分?jǐn)?shù)均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且均符合各型程度的TBI標(biāo)準(zhǔn)。為確保實驗數(shù)據(jù)可靠性，我們還觀察了損傷后大鼠腦組織的病理學(xué)變化，首先手術(shù)組大鼠挫裂灶局部均出現(xiàn)腦組織碎裂，中、重度TBI更伴有片狀出血，在損傷灶周圍形成明顯的水腫帶，水腫帶內(nèi)可見多數(shù)星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯腫脹，部分神經(jīng)元胞核丟失，血管受壓變形，破裂出血，對照組為正常腦皮質(zhì)。本實驗通過LFP法，首選建立了穩(wěn)定可靠的大鼠TBI模型，為后續(xù)實驗提供重要的保障和基礎(chǔ)。

國內(nèi)外多項研究發(fā)現(xiàn)Notch 1信號通路作為NSCs增殖分化的重要調(diào)節(jié)通路[11]，它可以誘導(dǎo)神經(jīng)前體細(xì)胞繼續(xù)增殖或向神經(jīng)元分化[12]，經(jīng)典Notch信號通路是Notch蛋白通過與其配體結(jié)合[14]，經(jīng)歷一系列蛋白水解過程釋放NICD，在細(xì)胞核形成CSL復(fù)合物，激活了Hes/Hey家族中Notch信號通路的目的基因，從而使NSCs處于未分化狀態(tài)，同時抑制原神經(jīng)基因包括Ascl 1的表達(dá)。NSCs中Notch信號通路的抑制可導(dǎo)致NSCs的缺失和神經(jīng)損傷。雖然現(xiàn)在Notch信號通路是否對NSCs的異質(zhì)性有影響，有待深入研究，但是通過破壞不同Notch信號通路中的組成會影響神經(jīng)再生的各個發(fā)展過程[11，13]。而我們前期研究中也發(fā)現(xiàn)在TBI的發(fā)生發(fā)展中，內(nèi)源性NSCs的數(shù)目較正常腦組織明顯增多。基于以上這些發(fā)現(xiàn)，我們猜測Notch 1信號通路很可能參與了TBI的發(fā)展過程。在前期基礎(chǔ)上，我們建立不同程度的閉合性TBI動物模型，運用分子生物學(xué)技術(shù)檢測Notch 1信號通路蛋白Jagged 1及Hes 1的表達(dá)變化，免疫組織化學(xué)及Western blot法檢測結(jié)果均顯示，手術(shù)組Jagged 1和Hes 1的表達(dá)量均大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且Notch 1信號通路蛋白的表達(dá)量隨著腦損傷程度的增加而增加，手術(shù)組組內(nèi)差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明Notch 1信號通路可能在TBI中起著重要的作用。

[1] 林建虎, 何學(xué)雄, 陸川, 等. 血漿NSE測定在中重度顱腦外傷中的應(yīng)用[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011, 41(6): 538-540.

[2] 王忠誠, 趙元立. 加強(qiáng)顱腦外傷臨床基礎(chǔ)研究提倡規(guī)范化治療[J]. 中華神經(jīng)外科雜志, 2001, 17(3): 133-134.

[3] 王偉, 王偉民. 顱腦外傷后運動障礙[J]. 中國微侵襲神經(jīng)外科雜志, 2003, 8(11): 523-526.

[4] Ahmed AI, Shtaya AB, Zaben MJ, et al. Endogenous GFAP-positive neural stem/progenit or cells in the postnatal mouse cortex are activated following traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2012, 29(5): 828-842.

[5] Sun D, Bullock MR, Altememi N, et al. The effect of epidermal growth factor in the injured brain after trauma in rats[J]. J Neurotrauma, 2010, 27(5): 923-938.

[6] South AP, Cho RJ, Aster JC. The double-edged sword ofNotch signaling in cancer[J]. Semin Cell Dev Biol, 2012, 23(4): 458-464.

[7] Zheng W, Zhuge Q, Zhong M, et al. Neurogenesis in adult human brain after traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2013, 30(22): 1872-1880.

[8] Zhuge Q, Zhong M, Zheng W, et al. Notch-1 signalling is activated in brain arteriovenous malformations in humans[J]. Brain, 2009, 132(12): 3231-3241.

[9] Yoneyama M, Shiba T, Hasebe S, et al. Adult neurogenesis is regulated by endogenous factors produced during neurodegeneration[J]. J Pharmaco Sci, 2011, 115(4): 425-432.

[10] Alder J, Fujioka W, Lifshitz J, et al. Lateral fluid percussion: model of traumatic brain injury in mice[J]. J Vis Exp, 2011 (54): 3063.

[11] Haupt S, Borghese L, Brustle O, et al. Non-genetic modulation of Notch activity by artificial delivery of Notch intracellular domain into neural stem cells[J]. Stem Cell Rev, 2012, 8(3): 672-684.

[12] Harada K, Sato Y, Ikeda H, et al. Notch1-Hes1 signalling axis in the tumourigenesis of biliary neuroendocrine tumours[J]. J Clin Pathol, 2013, 66(5): 386-391.

[13] Wang X, Mao X, Xie L, et al. Involvement of Notch1 signaling in neurogenesis in the subventricular zone of normal and ischemic rat brain in Vivo[J]. J Cerebral Blood Flow Meta, 2009, 29(10): 1644-1654.

[14] Xiao MJ, Han Z, Shao B, et al. Notch signaling and neurogenesis in normal and stroke brain[J]. J Physiol Pathophysiol Pharmacol, 2009, 1(2): 192-202.

（本文編輯：吳彬）

The expression of Notch 1 signaling pathway proteins in rat models of different degree traumatic brain in-jury

WANG Wei, GAO Zhichao, ZHU Penglei, ZHENG Weiming, TU Ming. Department of Neurosurgery, theFirst Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: By detecting Notch 1 signaling pathway proteins Jagged 1 and Hes 1 in light of heavy colsed craniocerebral injury. The role of Notch 1 signaling pathways in traumatic brain injury was explore and the new direction of treatment for closed craniocerebral injury was provide. Methods: Use lateral fluid percussion method to make the light, medium and heavy closed craniocerebral trauma models. Groups of rats after 24 h of neurologic deficits were evaluated through the nervous system disease severity score (NSS), then use immunohistochemistry and Western blot methods were used to detect Notch 1 signaling pathway downstream factors Jagged 1 and Hes 1. Results: The NSS score difference among the TBI groups was statistically significant (P＜0.05), the brain contusion was heavier, the neurologic deficits were more obvious, which means the model was established successfully. Immunohistochemistry and Western blot showed that in brain contusion the expression of Hes 1 and Jagged 1 levels were significantly higher than that the control group (P＜0.05), and increased with the degree of brain injury, the expression of the proteins was increased. Conclusion: Notch 1 signaling pathway may be involved in the development process of craniocerebral injury, and may become the new target for therapy after traumatic brain injury.

traumatic brain injury; lateral fluid percussion; Notch 1 signaling pathway

R651.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.07.005

2015-03-17

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（Y13H090051）。

王偉（1988-），男，安徽合肥人，碩士生。

鄭偉明，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zhwm61@ 126.com。