2型糖尿病小鼠小腦代謝物的1H NMR研究

魏婷婷，鄭涌泉，王慧，夏歡歡，許翠翠，葉信健，趙良才，高紅昌

（溫州醫科大學 藥學院 代謝組學與醫藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

·論 著·

2型糖尿病小鼠小腦代謝物的1H NMR研究

魏婷婷，鄭涌泉，王慧，夏歡歡，許翠翠，葉信健，趙良才，高紅昌

（溫州醫科大學 藥學院 代謝組學與醫藥核磁共振研究所，浙江 溫州 325035）

目的：通過離體的高分辨核磁共振氫譜（1H NMR）技術研究2型糖尿病db/db小鼠小腦的代謝變化。方法：采用8只15周齡2型糖尿病模型db/db小鼠為實驗組，11只15周齡野生正常小鼠為對照組，對其小腦組織進行離體的1H NMR檢測分析。結果：實驗組與對照組相比小腦的代謝模式明顯不同，甘氨酸（Gly）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、N-乙酰天門冬氨酸（NAA）、丙氨酸（Ala）等代謝物濃度明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；谷氨酰胺（Gln）、牛磺酸（Tau）、乳酸（Lac）等代謝物水平顯著上升，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。結論：代謝組學結果說明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦中糖代謝、氨基酸代謝出現了紊亂，這為進一步認識糖尿病腦病的發病機制提供了線索。

代謝組學；糖尿病，2型；代謝物；核磁共振；db/db小鼠

糖尿病作為一個常見的慢性代謝類疾病，已經嚴重影響了人類的生活。WHO最新的流行病學資料顯示全世界已有3.47億人患有糖尿病[1]，這一數字還在不斷增長，其中2型糖尿病占90%以上[2]。糖尿病腦病作為糖尿病神經系統并發癥開始越來越受到關注[3]。研究顯示，糖尿病患者大腦在長期的高血糖狀態下代謝發生紊亂，其中包括生化特征改變、神經生理學、形態學變化以及認知功能障礙等[4]。然而此類腦病的發病機制目前還不清楚。

基于核磁共振（NMR）的代謝組學已成功應用于疾病的發病機制、早期診斷以及治療研究，越來越顯示出其在生命科學領域的重要地位[5]。本研究對象db/db小鼠為經典的2型糖尿病小鼠模型，小腦不僅僅與運動有關，而且參與非運動的認知功能[6]。本研究將利用基于核磁共振氫譜（1H NMR）的代謝組學方法分析2型糖尿病模型db/db小鼠小腦的整體代謝特征，這可能為闡明2型糖尿病腦病潛在發病機制提供重要的線索。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雄性2型糖尿病模型db/db小鼠（BKS.Cg-m+/+Leprdb/J）8只（15周齡）為實驗組，雄性野生型小鼠11只（15周齡）為對照組，購自南京大學模式動物研究所，飼養于溫州醫科大學實驗動物中心SPF級動物房，自早上8∶00開始12 h交替照明。所有小鼠適應性飼養1周再進行實驗，實驗期間自由飲水、進食，所有的操作程序嚴格遵守NIH的實驗動物飼養和使用手冊。飼養至17周斷頭處死，在冰上分離小腦，迅速置于液氮中猝滅，將收集的樣本置于-80 ℃超低溫冰箱中儲存待測。

1.2 試劑與儀器 三甲硅烷基丙磺酸鈉（TSP）購自Sigma-Aldrich公司；D2O（99.9%氘代）購于劍橋同位素實驗室；甲醇和氯仿購于上海國藥集團化學試劑有限公司；純水由Milli-Q超純水系統（Millipore，Billerica，MA，USA）生產。使用Bruker AVANCE I I I 600 MHz NMR波譜儀（Bruker BioSpin International AG）進行分析，低溫離心機5415R（eppendorf Inc，Germany）離心。

1.3 方法

1.3.1 組織萃取：將冰凍組織稱質量并放入離心管中，應用甲醇-氯仿-水按一定比例萃取，離心后取上清液，凍干24 h，重新溶解于500 mL D2O中進行NMR檢測。

1.3.21H NMR檢測：于600 MHz NMR波譜儀上進行NMR采集實驗，累加采樣256次，數據采集點為32 K，譜寬為12 000 Hz，弛豫延遲10 s。進行傅立葉變換前，將采集的FID信號充零至64 K，并加窗函數LB=0.3。使用Topspin 2.1軟件對所有的1H NMR譜圖都進行相位校正、基線調整，并以乳酸的甲基峰的化學位移為1.33 ppm定標。

1.3.3 NMR波譜數據處理和模式分析：將1H NMR譜從δ-0.2～8.8 ppm按0.01 ppm為單位進行自動分段積分[7]，為了消除預飽和壓水峰時引起的譜線扭曲，將δ5.85～4.60 ppm區域設為0積分段。對每一段積分值都相對于該譜的所有積分值進行歸一化，然后將數據導入SIMCA-P+12.0軟件包（瑞典Umetrics 公司），進行多元統計分析。偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）用于代謝模式和重要代謝物的研究。

1.4 統計學處理方法 采用SPSS 13.0軟件將歸一化后的積分值導入作統計學分析。2組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組小鼠體質量和血糖測定 實驗組小鼠“三多一少”糖尿病癥狀表現明顯，且覓食過程比對照組緩慢。13周齡實驗組小鼠體質量明顯高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。實驗組小鼠空腹血糖值持續≥16.7 mmol/L，見表1。

表1 2組小鼠體質量和空腹血糖值比較（±s）

表1 2組小鼠體質量和空腹血糖值比較（±s）

與對照組比：aP＜0.01

2.2 2組小腦組織1H NMR譜圖及PLS-DA分析 腦組織提取物的1H NMR波譜可以同時測量多種內源性代謝物，于圖中標出丙氨酸（Ala，δ 1.46），乳酸（Lac，δ 1.33），γ-氨基丁酸（GABA，δ 2.29），N-乙酰天門冬氨酸（NAA，δ 2.02），谷氨酸（Glu，δ 2.35），天冬氨酸（Asp，δ 2.82），谷氨酰胺（Gln，δ 2.45），琥珀酸（Suc，δ2.40），肌酸（Cr，δ3.03），膽堿（Cho，δ 3.20），牛磺酸（Tau，δ 3.42），甘氨酸（Gly，δ 3.55）和肌醇（m-Ins，δ 4.06），見圖1。2組代謝特征明顯不同，Lac、Tau、NAA、Cho等代謝物對2組間分離貢獻較大，見圖2。

圖1 對照組小鼠（A）和實驗組小鼠（B）小腦典型的1H NMR波譜圖

2.3 2組小鼠代謝物變化情況 與對照組相比，實驗組小鼠小腦中Lac、Gln和Tau水平顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；Gly、Aap、Glu、GABA、NAA和Ala水平顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；m-Ins、Cre、Cho和Suc變化差異沒有統計學意義（P＞0.05），見圖3。

3 討論

本實驗對2型糖尿病模型db/db小鼠小腦的代謝輪廓和代謝變化進行分析，標出的代謝物都基于我們前期已發表的研究成果[6，8]，并且經過2D1H-1H COSY和TOCSY譜圖驗證。我們發現持續的高血糖能夠明顯影響神經化學物質代謝，包括一些重要的興奮性和抑制性神經遞質如Glu、Gln、GABA、Asp和Gly，表明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內神經元的興奮性程度發生了改變。除此之外，能量代謝產物Lac和Ala的變化揭示了其小腦能量代謝的改變。

圖2 模式識別分析結果

圖3 小腦內各代謝物相對濃度柱狀圖

3.1 氨基酸類神經遞質代謝紊亂 Glu是腦中最重要、分布最廣的興奮性神經遞質[9]，在中樞神經系統生理、病理以及毒理學研究中有著重要的意義[8]。近年來，越來越多的研究證實哺乳動物腦內存在兩個代謝區間，其中一個是神經元代謝區間，另一個是神經膠質代謝區間。神經元釋放出的Glu被星形膠質細胞攝取轉化為Gln，Gln再被送回神經元而轉化為Glu，見圖4。這種發生在神經元和星形膠質細胞之間的神經遞質循環稱為Gln-Glu循環[10]。我們發現2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內Glu、GABA含量顯著性降低，Gln含量顯著性升高，可能是Gln在向谷氨酸能神經元和γ-氨基酸能神經元運輸過程發生障礙，導致星形膠質細胞Gln含量升高，也有可能是持續的高血糖使得腦內神經膠質細胞過度增生。Gln-Glu循環的紊亂，間接反映小腦中神經元代謝區間和神經膠質代謝區間可能存在紊亂。此外，我們發現小腦興奮性氨基酸Asp和抑制性氨基酸Gly也出現顯著性下降，進一步證實氨基酸類神經遞質在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內可能存在代謝紊亂。

圖4 腦中神經元和神經膠質細胞間Gln-Glu循環圖

3.2 能量代謝紊亂 腦能量需求幾乎全部來自線粒體中葡萄糖的氧化代謝，當神經元對能量的需求超過氧化代謝速率時，Lac就會作為能量底物而被利用[11]。與野生型對照組相比，我們發現2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內乳酸含量明顯升高，而Ala含量明顯降低，這可能是由于能量底物葡萄糖在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內無氧酵解途徑增強，能量利用率降低。但是，我們發現三羧酸循環中間產物Suc的含量并沒有顯著性變化，說明腦內的有氧呼吸途徑改變不明顯，這很可能是由Glu通過轉化為α-酮戊二酸進入到三羧酸循的途徑增強，Glu含量下降與上述分析一致。綜上所述，我們認為2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內能量代謝出現障礙，持續的高血糖導致神經細胞無氧降解途徑增強，能量代謝障礙，為了彌補能量的空缺，使得Glu等能量代謝旁路途徑代謝增強，這同樣與小腦中Glu含量顯著降低一致。

3.3 其他代謝產物變化 NAA通常被認為是神經元的標志物，它的升高或降低都與神經元活性息息相關[12]，在2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內我們發現NAA明顯降低。這表明，高血糖狀態下2型糖尿病模型db/db小鼠可能發生神經元功能性障礙。Tau被認為是星形膠質細胞活性的標志物，它對調節星形膠質細胞胞內滲透壓起到重要作用[13]。小腦中Tau水平顯著性升高，這說明持續高血糖會影響星形膠質細胞的活性。Cr是一種氨基酸，經過磷酸化作用，作為能量儲存在細胞中[14]。在1H NMR譜中，Cr峰的位置相對穩定，在絕大部分疾病發生時，腦內Cr濃度幾乎保持恒定狀態[15]，這和我們觀察到的小腦Cr差異無統計學意義是一致的。Cho是細胞膜的主要成分，它的變化可能與腫瘤和組織炎癥的發生有關[16]。小腦中Cho的降低可能暗示了持續高血糖使小鼠小腦內細胞的新陳更替程度降低。

本實驗應用1H NMR技術研究2型糖尿病db/db小鼠小腦的代謝變化。基于1H NMR的代謝組學結果表明2型糖尿病db/db小鼠小腦內的代謝輪廓與野生型對照小鼠相比發生了明顯改變；代謝物的定量1H NMR分析表明2型糖尿病模型db/db小鼠小腦內氨基酸類神經遞質和能量代謝出現異常。這些結果提示2型糖尿病db/db小鼠小腦中Gln-Glu循環平衡被打破，糖酵解途徑增強。近年來，越來越多的研究證實小腦與認知、行為及精神疾病密切相關[5，17]。行為學數據表明，與對照組相比，2型糖尿病模型db/db小鼠在水迷宮實驗中表現為潛伏時間延長并且穿臺次數顯著減少，出現了明顯的認知功能障礙，Gln-Glu循環和糖酵解途徑的紊亂可能參與了高血糖引起的小腦纖維聯系與非運動認知功能紊亂的發病過程[18]。本實驗從代謝水平初步探討了糖尿病腦損傷的可能機制，為深入認識糖尿病腦病的分子機制提供了一定的理論依據。

[1]Whiting DR, Guariguata L, Weil C, et al.IDF diabetesatlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011and 2030[J].Diabetes Res Clin Pract, 2011, 94(3): 311-321.

[2]Chang KH, Chuang TJ, Lyu RK, et al.Identification of gene networks and pathways associated with Guillain-Barre syndrome[J].Plos One, 2012, 7(1): e29506.

[3]吳亮, 劉網網, 焦立卓, 等.棉酚對2型糖尿病大鼠大腦皮層及海馬神經元凋亡相關基因表達的影響[J].溫州醫學院學報, 2013, 43(9): 567-577.

[4]Pop-Busui R, Lu J, Lopes N, et al.Prevalence of diabetic peripheral neuropathy and relation to glycemic control therapies at baseline in the BARI 2D cohort[J].J Peripher Nerv Syst, 2009, 14(1): 1-13.

[5]Psihogios NG, Gazi IF, Elisaf MS, et al.Gender-related and age-related urinalysis of healthy subjects by NMR-based metabonomics[J].NMR Biomed, 2008, 21(3): 195-207.

[6]尹順雄, 閔連秋.小腦在血管性認知功能障礙中的作用[J].中國卒中雜志, 2013, 8(10): 844-848.

[7]朱環, 管咪咪, 鄭涌泉, 等.糖尿病早期大鼠血清代謝輪廓的變化[J].溫州醫學院學報, 2013, 43(12): 784-787.

[8]吳強恩, 鄭力行, 謝芳, 等.反相高效液相色譜熒光法測定大鼠腦組織中氨基酸類神經遞質[J].復旦學報(醫學版), 2005, 32(3): 355-358.

[9]王杰, 劉青, 姜立紅, 等.大腦能量代謝和神經傳遞動力學的NMR測定方法[J].波譜學雜志, 2010, 27(3): 341-354.

[10] Gao HC, Zhu H, Song CY, et al.Metabolic changes detected by ex vivo high resolution 1H NMR spectroscopy in the striatum of 6-OHDA-induced Parkinson’s rat[J].Mol Neurobiol, 2013, 47(1): 123-130.

[11] 楊東升, 劉曉莉, 喬德才.“乳酸穿梭”背景下的運動性疲勞中樞機制研究新進展[J].中國康復醫學雜志, 2012, 27 (3): 285-288.

[12] Zhang X, Liu H, Wu J, et al.Metabonomic alterations in hippocampus, temporal and prefrontal cortex with age in rats[J].Neurochem Int, 2009, 54(8): 481-487.

[13] Isaacks RE, Bender AS, Kim CY, et al.Osmotic regulation of myo-inositol uptake in primary astrocyte cultures[J].Neurochem Res, 1994, 19(3): 331-338.

[14] Sartorius A, Lugenbiel P, Mahlstedt MM, et al.Proton magnetic resonance spectroscopic creatine correlates with creatine transporter protein density in rat brain[J].J Neurosci Methods, 2008, 172(2): 215-219.

[15] 李春霞, 王亞強, 潘文舉, 等.長期慢性強迫游泳應激抑郁模型大鼠前額葉腦代謝物的1H NMR研究[J].武漢大學學報(理學版), 2008, 54(4): 451-456.

[16] Govindaraju V, Young K, Maudsley AA.Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites[J].NMR Biomed, 2000, 13(3): 129-153.

[17] 郭旭, 李云.小腦認知功能的臨床研究進展[J].中國醫藥指南, 2013, 11(20): 492-493.

[18] Zhao Q, Matsumoto K, Tsuneyama K, et al.Diabetesinduced central cholinergic neuronal loss and cognitive defcit are attenuated by tacrine and a Chinese herbal prescription, kangen-karyu: elucidation in type 2 diabetes db/db mice[J].J Pharmacol Sci, 2011, 117(4): 230-242.

（本文編輯：吳彬）

1H NMR-based metabonomic study on cerebellum of type 2 diabetes mellitus model

WEI Tingting,ZHENG Yongquan, WANG Hui, XIA Huanhuan, XU Cuicui, YE Xinjian, ZHAO Liangcai, GAO Hongchang.Institute of Metabonomics & Medical NMR, School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To investigate the diabetes-related metabolic changes in the cerebellum of db/db mice.Methods:Specimens of the cerebellum were dissected from the 17-week db/db mice and the age-matched controls.The cerebellum tissue samples were extracted and analyzed by1H NMR-based metabonomics.Results: Compared to the controls, the db/db mice exhibited markedly different metabolic profles, which included signifcant decrease in the levels of glycine (P＜0.01), aspartate (P＜0.01), glutamate (P＜0.01), GABA (P＜0.01), N-acetyl-aspartate (P＜0.01) and alanine (P＜0.05) and increase in the levels of glutamine (P＜0.01), taurine (P＜0.05) and lactate (P＜0.01).Conclusion:These metabolic changes suggest that glucose metabolism and amino acid metabolism in the cerebellum of db/db mice are disordered, which provides clues for further understanding the pathogenesis of diabetic encephalopathy.

metabonomics; diabetes, type 2; metabolite; NMR; db/db mice

R34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.009

2014-10-08

溫州醫科大學2012年國家級大學生創新創業訓練計劃資助項目（201210343009）；浙江省自然科學基金資助項目（LY14H090014，LY13H070005）；高等學校博士學科點專項科研基金-新教師類資助項目（20133321120006）；溫州市科技計劃項目（Y20100005）。

魏婷婷（1990-），女，浙江金華人，碩士生。

高紅昌，教授，博士生導師，Email：gaohc27@wmu.edu.cn。