脂多糖對人臍血內皮祖細胞增殖及凋亡的影響

李金海，陳輝春，戴華衛，張海峰，王烈

（1.溫州醫科大學附屬第三醫院 普外科，浙江 溫州 325200；2.南京軍區福州總醫院 普外科，福建福州 350025）

·論 著·

脂多糖對人臍血內皮祖細胞增殖及凋亡的影響

李金海1，陳輝春1，戴華衛1，張海峰1，王烈2

（1.溫州醫科大學附屬第三醫院 普外科，浙江 溫州 325200；2.南京軍區福州總醫院 普外科，福建福州 350025）

目的：觀察脂多糖（LPS）對體外培養的人臍血內皮祖細胞（EPCs）增殖及凋亡的影響。方法：以密度梯度離心法獲取人臍血EPCs，體外誘導分化并鑒定。實驗分對照組及不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L）LPS組。四氮唑藍（MTT）法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀測凋亡率及細胞周期。結果：①10.0 mmol/L組促進EPCs增殖，20.0 mmol/L組抑制EPCs增殖，差異有統計學意義（P＜0.05），其余2組對EPCs增殖能力無顯著影響，與對照組比差異無統計學意義（P＞0.05）。②20.0 mmol/L組促進EPCs凋亡，差異有統計學意義（P＜0.05）。其余各組對EPCs凋亡率無明顯影響，與對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。③10.0、20.0 mmol/L組影響細胞周期，10.0 mmol/L組G0/G1期細胞減少，S和G2/M期增加；20.0 mmol/L組發生S期阻滯，G2/M期細胞減少，與對照組比差異有統計學意義（P＜0.05）。結論：LPS對EPCs增殖能力及凋亡的影響與其濃度有關，當濃度為20.0 mmol/L時抑制增殖并促進凋亡。

脂多糖；內皮，血管；細胞增殖；細胞凋亡

內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為血管內皮細胞的前體細胞，在血管修復及新生血管形成過程中發揮重要作用，因此在治療缺血性疾病方面有著廣闊的應用前景[1]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細胞壁的重要成分，影響細胞自噬，對細胞的增殖能力及凋亡的把控是當今研究的熱點[2-3]。本研究探討各種濃度的LPS對人臍血EPCs分化增殖、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 臍帶血取自2012年7月-2013年7月溫州醫科大學附屬第三醫院婦產科健康產婦，均經產婦知情同意，并經醫院倫理委員會許可。淋巴細胞分離液（美國R&D System公司）；EGM-2MV EPCs培養基（杭州百通生物公司）；LPS、四氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（均為德國Roche公司），DiI-acLDL（美國Molecular Probe公司），FITC-UEA-I（美國Fermentas Life Science公司），Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（北京寶賽生物技術有限公司）；DNA含量檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培養：取產婦臍帶血50 mL，用等倍的PBS稀釋后，按1∶1比例加入淋巴細胞分離液，離心后取出單個核細胞層，用PBS清洗，滴加EPCs培養基（EGM-2MV），以1×106個/cm2密度接種于包被有人纖維連接蛋白的培養瓶中，5% CO2、37 ℃環境下培養3 d。用PBS液洗掉非貼壁細胞，收集貼壁細胞備用。

1.2.2 EPCs鑒定：將貼壁細胞與濃度為2.4 μg/ mL Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-acLDL）在37 ℃孵育1 h后用2%多聚甲醛固定；再將濃度為10 μ g/mL FITC標記的荊豆凝集素-I滴加于上述標本中37 ℃孵育1 h，向已染色的標本上滴加1 μ g/mL Hoechst 33342，避光孵育2 h；PBS沖洗3次，蒸餾水沖洗1次，滴加緩沖甘油封片。通過激光共聚焦顯微鏡鑒定Dil-acLDL和結合FITC-UEA-I雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs。

1.2.3 實驗分組：將培養3 d的貼壁細胞消化、重懸后分5組：對照組（僅加入EGM-2MV）及在培養基的基礎上加入不同濃度LPS組（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L組），培養48 h后，收集細胞。各組用細胞計數器計數對細胞數量進行調整，使各組間細胞基數相等。

1.2.4 EPCs增殖能力檢測：以（1.5～2.0）×104細胞/孔的密度在在96孔培養板上將細胞接種。每組6孔，每孔100 μL，每組均設6復孔。培養終止前4 h加入MTT（5 mg/mL），10 μL每孔，37 ℃培養4 h后終止，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩20 min后，讓結晶物充分溶解。酶標儀測波長為570 nm時的吸光度A值，重復3次。

1.2.5 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率：嚴格按Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒進行操作，將培養3 d的貼壁細胞消化后收集，加PI染液10 μL，Annexin V-FITC染液5 μL，37 ℃孵育10 min，實驗重復3次，上機檢測。將貼壁細胞消化、離心后收集細胞（濃度為5×105個/cm2），70%冷乙醇4 ℃固定，加入結合緩沖液490 μL，混勻，4 ℃保存；加RNase A，37 ℃水浴30 min；再加入PI染色均勻，4 ℃避光30 min，放入流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。結果以±s表示，每組重復3次，各組樣本數據比較采用方差齊性檢驗，2組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EPCs鑒定 根據EPCs具有攝取acLDL和結合UEA-I的能力，收集培養3 d的貼壁細胞，激光共聚焦顯微鏡鑒定經FITC-UEA-I和DiI-acLDL單克隆抗體標記的EPCs，DiI-acLDL染色陽性細胞呈紅色，FITC-UEA-I染色陽性細胞呈綠色，FITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽性細胞視為正在分化的EPCs，呈黃色（見圖1）。

圖1 雙熒光染色鑒定EPCs（×400）

2.2 EPCs增殖能力及凋亡的檢測 LPS作用48 h對EPCs增殖能力的影響：與對照組比較，10.0 mmoL/L組細胞增殖能力明顯增強，差異有統計學意義（t= 5.43，P＜0.05）；20.0 mmoL/L組細胞增殖能力明顯下降，差異有統計學意義（t=3.01，P＜0.05）；2.5 mmol/L、5.0 mmoL/L組與對照組比較，差異無統計學意義（分別t=0.38、t=0.72，均P＞0.05）（見表1）。LPS作用48 h對EPCs凋亡的影響：2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L、10.0 mmoL/L組與對照組凋亡率比較，差異無統計學意義（分別t=1.98、t=2.77、t=3.22，均P＞0.05）；20.0 mmoL/L組與對照組比較凋亡率明顯增加，差異有統計學意義（t=5.14，P＜0.05）；10.0 mmoL/L與20.0 mmoL/L組比較，細胞增殖差異有統計學意義（t=8.14，P＜0.05），凋亡率差異亦有統計學意義（t=5.89，P＜0.05）（見表1）。

表1 LPS作用48 h對EPCs增殖及凋亡的影響（n=3，±s）

表1 LPS作用48 h對EPCs增殖及凋亡的影響（n=3，±s）

與對照組比：aP＜0.05；與10.0 mmoL/L組比：bP＜0.05

2.3 LPS對EPCs細胞周期的影響 LPS作用48 h，其濃度為2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L時，EPCs主要積聚于G0/G1期，G0/G1、S期、G2/M期細胞數與對照組比較，差異無統計學意義（分別t=1.45、t=0.65、t=1.51、t=3.37、t=0.51、t=0.68，P＞0.05）；LPS濃度為10.0 mmoL/L，S期及G2/M期細胞數增加，G0/ G1期細胞數減少，各期細胞數與對照組比較，差異有統計學意義（分別t=6.12、t=4.48、t=11.42、t=8.56、t=27.18、t=6.77，P＜0.05）；10 mmoL/L 與20 mmoL/L組G0/G1期細胞數比較，差異無統計學意義（t=1.78，P＞0.05），S期、G2/M期細胞數比較，差異有統計學意義（分別t=6.98、t=9.12，P＜0.05）（見表2）。

表2 LPS對EPCs周期的影響（n=3，±s，%）

表2 LPS對EPCs周期的影響（n=3，±s，%）

與對照組比：aP＜0.05；與10.0 mmoL/L組比：bP＜0.05

3 討論

EPCs作為血管內皮細胞的前體細胞，在缺血疾病、創傷愈合及血管內皮修復中發揮重要作用，探尋影響其增殖及凋亡的物質有著重要的臨床意義[4]。在機體受到創傷后，受損的細胞會自發形成自噬泡，溶酶體與自噬泡結合形成自噬小體，后者被體內一些酶類分解為小分子物質后發揮修復、愈合創傷細胞的作用。所以，自噬是細胞在應激狀態下的一種自我保護機制，對機體穩態的維持有重要意義。已有研究證實，LPS可通過直接誘導及間接激活途徑參與細胞的自噬過程，這些途徑可能均與活性氧反應有關，但具體機制尚不清楚[5]。

本研究顯示，藥物作用48 h后與對照組比較，濃度為2.5、5.0 mmoL/L的LPS對EPCs增殖及凋亡均無顯著影響，差異無統計學意義（P＞0.05），EPCs多停滯于G0/G1期；在G0/G1期、S期、G2/M期，EPCs在的細胞數量方面與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。對比對照組，10.0 mmoL/L的LPS可顯著提高EPCs的增殖能力，差異有統計學意義（P＜0.05），對EPCs凋亡影響不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05），EPCs數量在G0/G1期減少，而在S和G2/M期增加，且差異有統計學意義（P＜0.05），所以，EPCs向S期及G2/M期分化過程中，10.0 mmoL/L 的LPS發揮顯著促進作用，進而促進EPCs增殖能力。對比對照組，20.0 mmoL/L的LPS可抑制EPCs增殖能力，并促進其凋亡，差異有統計學意義（P＜0.05）；對比對照組，細胞主要集聚于S期，且G2/M細胞數量下降，差異有統計學意義（P＜0.05），證實細胞被阻滯于S期可能，導致細胞進一步分化受到抑制，抑制細胞增殖。上述實驗結果證實，對比對照組，相對偏低濃度（2.5、5.0 mmoL/L）的LPS對EPCs的增殖能力及凋亡無明顯影響；中等濃度（10.0 mmoL/L）的LPS可明顯促進EPCs增殖能力，在凋亡方面對EPCs無明顯影響；較高濃度（20.0 mmoL/L）LPS可明顯抑制細胞增殖能力，并顯著促進細胞凋亡。

自噬是細胞應對不利生存條件下的一種防御反應，對細胞有保護作用，并參與免疫應答；凋亡是細胞不能耐受外界有害刺激時出現的主動性死亡[6-7]。自噬多發生于凋亡之前，他們都是維持穩態的重要機制，雖然細胞自噬性死亡在機制和形態學上均不同于凋亡，但二者在信號通路上存在某些交叉，二者的誘發因素也有很大程度的一致性，且均與細胞的自我調節功能有關[8-9]。結合本研究，隨著LPS濃度的不斷增加對EPCs增殖能力并沒有相應得到促進，考慮細胞為維持自身穩態，對自噬功能進行自我調節有關，其具體機制也是我們下一步研究的重點。EPCs的凋亡與LPS濃度呈現一定的依賴性，考慮較大劑量的藥物濃度導致細胞中毒，超越細胞自我調節的限度，致使細胞凋亡[10]。因此，自噬的調控只能局限于一定藥物濃度范圍，過量的藥物濃度致使自噬被過度抑制，將可能導致細胞凋亡。由此相信，若能找到LPS對ECPs作用的最適合藥物濃度，就可能有效控制EPCs的增殖能力及凋亡。隨著研究的不斷深入，LPS對于EPCs生物學特性的影響也將成為日后缺血性疾病干預的重要靶點。

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（本文編輯：胡苗苗）

Effects of lipopolysaccharide on proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial progeni-tor cells

LI Jinhai1, CHEN Huichun1, DAI Huawei1, ZHANG Haifeng1, WANG Lie2.1.Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200; 2.Department of General Surgery,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou, 350025

Objective:To investigate the effect of proliferation, apoptosis and cell cycle of lipopolysaccharide (LPS) on human umbilical vein endothelial progenitor cells.Methods:mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood.Mononuclearcells (MNCs) were isolated from human umbilical cord blood in vitro by Ficoll density gradient centrifugation.EPCs were characterized as adherent cells with double positive to DiI-acLDL uptake and lectin binding by direct fuorescent staining under a laser scanning confocal microscope.There were fve groups.The control group and four LPS concentration groups: 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mmol/L.MTT was used to detect cell apoptosis and cell cycle.Results: ①10.0 mmol/L LPS promotes proliferation of EPCs, while 20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation of endothelial progenitor cells (P＜0.05).②20.0 mmol/L LPS promotes apoptosis of EPCs, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).③LPS at the concentration of 10.0 mmol/L reduces cells at G0/G1phase and increases S and G2/M phase cells; 20.0 mmol/L LPS induces EPCs blockade at S phase, G2/M phase cells decreased, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).Conclusion:10.0 mmol/L LPS promotes the proliferation of EPCs.20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation and promotes apoptosis of EPCs.

lipopolysaccharide; endothelium, vascular; proliferation; apoptosis

R331.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.008

2014-06-03

福建省自然科學基金資助項目（2009J01186）。

李金海（1983-），男，山東棗莊人，主治醫師，碩士。

王烈，主任醫師，博士生導師，Email：lijindahai@ 126.com。