沉默熱休克蛋白27基因增強大腸癌細胞對5-FU化療敏感性

黃崇杰，劉長寶，鄭晨果，蔡錨

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

沉默熱休克蛋白27基因增強大腸癌細胞對5-FU化療敏感性

黃崇杰，劉長寶，鄭晨果，蔡錨

（溫州醫科大學附屬第二醫院 肛腸外科，浙江 溫州 325027）

目的：探討不同大腸癌細胞熱休克蛋白（HSP27）蛋白表達水平及其與5-氟尿嘧啶（5-FU）化療敏感性的關系，同時通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達，初步探討沉默該基因對5-FU抗腫瘤作用的影響。方法：Western blot法檢測各大腸癌細胞中HSP27蛋白的表達水平，CCK-8法測定不同濃度5-FU對各細胞株的抑制率，分析各組細胞HSP27蛋白表達水平與IC50的關系。設計合成3對針對不同靶點的HSP27小干擾RNA，通過脂質體轉染SW480細胞，激光共聚焦顯微鏡觀察轉染效率，Real-time PCR及Western blot法檢測轉染后HSP27 mRNA及蛋白表達水平。CCK-8法檢測HSP27-siRNA對細胞的生長抑制作用及沉默HSP27基因細胞對5-FU化療敏感性的變化。結果：各組細胞中HSP27的表達水平與5-FU的敏感性呈負相關性。Real-time PCR及Western blot法結果顯示有兩對靶向HSP27-siRNA能有效抑制HSP27 mRNA及蛋白水平的表達；CCK-8法檢測結果顯示HSP27-siRNA轉染可增強SW480細胞對5-FU的敏感性，半數抑制濃度（IC50）明顯下調。HSP27在大腸癌細胞中的表達水平與5-FU化療藥IC50值呈正相關。結論：靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細胞HSP27蛋白的表達，增強5-FU化療藥物的敏感性。

結直腸腫瘤；熱休克蛋白27；5-氟尿嘧啶；RNA干擾

大腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年來發病率呈逐年上升趨勢[1]。治療上以外科手術為主，但對中晚期的患者，以5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）為基礎的化療方案成為必需的輔助治療，然而腫瘤細胞內在的或獲得性耐藥是化療失敗

并導致腫瘤復發的主要原因[2]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27是HSP家族中的重要一員，最近的蛋白組學研究表明，其在結直腸癌中呈現過表達，且與化療耐藥和預后不良存在必然聯系[3]，亦有國外文獻報道，5-FU能夠誘導HSP27表達從而促進細胞生存，抑制5-FU療效[4]，但其耐藥機制尚未闡明。本研究首先探討了不同大腸癌細胞HSP27蛋白表達水平與5-FU化療敏感性關系，篩選出高表達HSP27的細胞后，通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達，并初步探討沉默該基因對5-FU抗腫瘤作用的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 人結腸癌細胞SW480、LOVO、HT-29、LS-174T購自中科院上海分院，我院實驗室常規保存；氟尿嘧啶干粉劑（5-FU）購自德國默克公司；RP-MI 1640培養基、優化培養基OPTI-MEMI、0.05%的胰酶、購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；β-actin鼠抗人抗體、兔抗人HSP-27抗體購自英國Abcam公司；HRP標記的山羊抗小鼠、山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒購自日本同仁化學研究所；轉染試劑LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；RT-PCR反轉錄試劑盒購自加拿大MBI fermentas公司；Real-time試劑盒購自日本Toyobo公司；HSP27 siRNA由上海吉瑪公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：各細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱內常規傳代培養。待細胞生長至約70%～90%的融合狀態時用于實驗。

1.2.2 藥物配制：將10 mg的5-FU粉劑溶于1 mL 的37 ℃ PBS溶液中，配制成104 μ g/mL的母液，于-20 ℃冰箱保存備用；用不含血清的培養基稀釋母液，配制成終濃度為10、20、40、80、160、320 μ g/mL的5-FU化療藥用于實驗。

1.2.3 Western blot法檢測不同種類結腸癌細胞HSP27蛋白的表達水平：取對數生長期狀態良好，經胰酶消化收集細胞，離心棄上清，PBS漂冼2次，用含1% PMSF的RIPA細胞裂解液裂解細胞提取總蛋白，BCA分析試劑測定樣品總蛋白濃度，調整蛋白濃度，煮沸變性10 min。每組各取100 μ g總蛋白樣品，以12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。將分離的蛋白轉移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉2 h。兔抗人HSP27抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜15 min×2次后加HRP標記的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG（1∶500），常溫孵育2 h，TBST洗膜15 min×2次。用增強化學發光法顯色，X線片曝光顯影。β-actin作為內參照標化蛋白質表達。用Quantity One凝膠成像分析系統進行半定量分析。

1.2.4 CCK-8法檢測不同種類細胞對5-FU的敏感性：取對數生長期細胞，經胰酶消化吹打成單細胞懸液，調整濃度為5×104/mL，接種于96孔培養板中，每孔100 μ L，每組設8個復孔。實驗分為空白調零對照組（不含細胞）、正常細胞對照組和5-FU藥物終濃度為（10、20、40、80、160、320 μ g/mL）的5-FU組。細胞經24 h貼壁，更換成無血清培養基培養24 h進行細胞同步化，再更換成上述含藥培養基繼續培養24 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養作用1 h后用酶標儀于450 nm波長測吸光度值（A值）。取8孔平均值，計算抑制率（IR）。IR（%）=[1-（實驗組A值-空白對照組A值）/（正常對照組A值-空白對照組A值）]×100%。

1.2.5 RNA干擾實驗：

1.2.5.1 siRNA的合成及制備。HSP27 siRNA由上海吉瑪公司設計合成，陰性轉染對照siRNA及5’-FAM熒光標記對照siRNA為上海吉瑪制藥有限公司提供的通用陰性對照siRNA（見表1）。按照吉瑪公司提供的siRNA使用說明書及實驗指導進行，先將各對HSP27 siRNA及陰性轉染對照siRNA分別溶解于Rnase-free ddH2O中，配成濃度為20 μmoL/L的母液，分裝于小EP管中，-20 ℃保存備用。

表1 3對不同靶點的HSP27-siRNA及negative control siRNA序列

1.2.5.2 實驗分組。5’-FAM標記的陰性siRNA轉染實驗分2組：①實驗組：即轉染5’-FAM標記陰性siRNA的SW480細胞；②正常對照組：未轉染的SW480細胞。

靶向HSP27的siRNA轉染實驗分組：①3組不同轉染實驗組：即轉染3對不同HSP27 siRNA的SW480細胞；②陰性轉染對照組：轉染negative controlsiRNA的SW480細胞；③正常對照組：未轉染的大腸癌SW480細胞。

1.2.5.3 細胞轉染。取對數生長期生長狀態良好的SW480細胞，以2×105個細胞/孔，接種于無菌6孔培養板和激光共聚焦專用培養板，細胞融合達60%左右時，進行轉染，轉染前2 h更換為OPTI-MEMI優化培養基，用OPTI-MEMI培養基稀釋siRNA，將稀釋液和轉染試劑LipofectamineTM2000混合，形成siRNA-轉染試劑復合物，將其加入細胞中，siRNA終濃度為100 nmol/L，置培養箱中孵育6 h后，吸棄培養液，PBS洗滌3次，滴加抗熒光淬滅劑后進行激光共聚焦顯微鏡觀察，以評估轉染效率。或換10% FBS的RPMI 1640培養液繼續培養48 h，收獲細胞提取總RNA和總蛋白。

1.2.6 Real-time PCR檢測基因轉染后大腸癌SW480細胞HSP27 mRNA表達水平：上述細胞經培養48 h后，吸棄培養液，先用PBS洗滌2次，吸棄PBS后把6孔板置于冰上操作，采用Trizol RNA分離試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度。按照Promega試劑盒產品說明書操作合成cDNA后進行Real-time PCR反應，按照Toyobo公司的Real-time PCR試劑盒說明書（SYBR Green法）操作。HSP27上游引物：5’-AGGATGGCGTGGTGGAGA-3’，下游引物：5’-G GGAGGAGGAAACTTGGGTG-3’，擴增產物129 bp；內參照GAPDH上游引物：5’-GGAGCAATGATCTTGATCTT-3’，下游引物：5’-CCTTCCTGGGCATGGAGTCCT-3’，擴增產物204 bp，均由上海生工合成。mRNA相對定量的計算方法：首先用Real-time PCR得到的目的基因Ct值分別與其相對應的內參的Ct值相減進行校正，得到目的基因的校正Ct值（△Ct），再以空白對照組中的平均校正Ct值作為本底參數，則目的基因的量：

每個實驗重復3次取平均值。

1.2.7 Western blot法檢測基因轉染后大腸癌SW480細胞HSP27蛋白的表達水平：將細胞接種于6孔板中，細胞分組同上，每組3孔，轉染組按上述方法轉染，48 h后收獲細胞，提取總蛋白進行Western blot法檢測，具體方法步驟（同1.2.3）。

1.2.8 HSP27-siRNA對SW480細胞存活率的影響：將對數生長期SW480細胞接種于96孔板，分為正常對照組、陰性轉染對照組、HSP27 siRNA組，每組設5個復孔，設空白調零對照。轉染組按前述方法進行轉染（同上1.2.5.3），上述轉染組細胞分別轉染培養（0、12、24、36、48、60 h）后行CCK-8試驗（具體步驟同1.2.4）。細胞存活率=（實驗組A值-空白對照組A值）/（正常對照組A值-空白對照組A值）。1.2.9 siRNA干擾靶向抑制結腸癌SW480細胞HSP27表達對5-FU敏感性影響：將SW480細胞接種于96孔板，分為正常對照組、陰性轉染對照組、HSP27 siRNA組，每組設5個復孔，轉染組按前述方法進行轉染，轉染48 h后各組棄培養液，用PBS漂洗3次，去除未貼壁的死細胞，再加入不同濃度（10、20、40、80、160、320 μg/mL）5-FU的含藥無血清培養基，繼續培養24 h后進行CCK-8檢測（具體步驟同1.2.4）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS17.0統計學軟件，計量資料以±s表示，多組資料比較采用ANOVA單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者采用LSD-t檢驗，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗，各細胞HSP27蛋白水平與半數抑制濃度（IC50）的關系采用直線相關性回歸分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Western blot法檢測4種結腸癌細胞株中HSP27蛋白的表達水平 4種結腸癌細胞均能檢測到HSP27蛋白的表達，但在不同細胞系中的水平存在一定差異。在SW480中表達最高，為1.38±0.06，LOVO最低，為0.77±0.04，且SW480細胞與其他各組細胞之間的差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 HSP27蛋白在4種不同類型人結腸癌細胞株中的表達水平

2.2 不同種類大腸癌細胞株對5-FU的敏感性及與HSP27表達相關性分析 各組細胞經6個不同濃度的5-FU處理24 h后，CCK-8試劑盒法通過酶標儀檢測OD值，分別計算細胞生長抑制率，不同組細胞對5-FU的敏感性用IC50值表示，結果顯示（見圖2）：各組細胞的IC50值存在較大差異，其中SW480細胞IC50均值（為102.43 μg/mL）最高，LOVO細胞（為50.25 μg/mL）最低，說明前者高表達HSP27細胞對5-FU化療藥物最不敏感，通過直線相關性分析顯示各組細胞HSP27的表達水平與IC50值呈正相關性（R=0.959，P＜0.05）。

2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察轉染效率 人大腸癌SW480細胞按上述方法轉染帶綠色熒光標記的陰性siRNA，6 h后于激光共聚焦顯微鏡下觀察，通過計算發綠色熒光細胞數與同一視野下普通光鏡細胞總數的比率測定轉染效率在80%以上（見圖3）。

2.4 Real-time PCR檢測SW480細胞轉染前后HSP27 mRNA的表達變化

2.4.1 擴增曲線和溶解曲線：圖4所示目的基因和內參基因熒光PCR擴增曲線良好，絕大部分CT值在20～30之間，PCR擴增反應良好，溶解曲線均為單峰，PCR擴增特異性較好。

2.4.2 HSP27 siRNA對SW480細胞HSP27 mRNA表達的影響：人大腸癌SW480細胞按上述方法轉染3對不同序列HSP27 siRNA、negative control siRNA或未轉染正常培養48 h后，收集細胞進行Real-time PCR檢測。各實驗組細胞中HSP27相對表達量結果見圖5。其中陰性轉染對照組和正常對照組之間HSP27 mRNA相對表達量差異沒有統計學意義（P＞0.05），siNRA-b組HSP27 mRNA的相對表達量為0.57±0.02，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；而siRNA-c組的相對表達量為0.31±0.01，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。表明siRNA-c組的干擾效果更好，在mRNA水平siRNA-c對靶基因HSP27抑制效率為69%。

圖2 不同人結腸癌細胞株對應5-FU化療藥的IC50值及與HSP27表達的相關性

圖3 激光共聚焦顯微鏡下熒光通道可見綠色熒光（×200）

圖4 各處理組細胞HSP27及內參基因Rea1-time PCR擴增曲線和溶解曲線圖

2.5 HSP27 siRNA對大腸癌SW480細胞HSP27蛋白水平表達的影響 見圖6。siRNA-b組大腸癌SW480細胞中HSP27蛋白相對表達量為0.82±0.09，與正常對照組（1.45±0.12）比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；siRNA-c組的表達量為0.56±0.08，與正常對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；而陰性轉染對照組和正常對照組之間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結果表明HSP27-siRNA干擾能抑制細胞HSP27蛋白的表達，在蛋白水平siRNA-c組的抑制效率為57.9%。

圖5 各實驗組SW480細胞中HSP27 mRNA的相對表達量

圖6 各實驗組SW480細胞中HSP27蛋白水平的相對表達量

2.6 HSP27-siRNA對SW480細胞生存的影響 將上述3組細胞（正常對照組、陰性轉染對照組、HSP27 siRNA組），分別培養（12、24、36、48和60 h）后，進行CCK-8試劑盒檢測。結果顯示，隨著時間延長，陰性轉染對照組、HSP27 siRNA組細胞存活均不同程度下降，前者分別為98.75±4.32、95.42±7.13、94.39±5.63、94.75±6.94、93.75±7.44，后者分別為96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47。兩者與正常對照組比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果表明終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480細胞生長，但不顯著。

2.7 siRNA干擾靶向抑制結腸癌SW480細胞HSP27表達對5-FU敏感性的影響 HSP27 siRNA-c干擾組細胞在用5-FU處理后，細胞生長情況與陰性轉染對照組和正常對照組相比明顯受到抑制，IC50值與兩對照組相比明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。結果提示靶向HSP27基因siRNA干擾可提高SW480細胞對化療藥物5-FU的敏感性。

表2 HSP27-siRNA靶向SW480細胞干擾對5-FU藥物敏感性的影響（n=3，±s）

表2 HSP27-siRNA靶向SW480細胞干擾對5-FU藥物敏感性的影響（n=3，±s）

與正常對照組和陰性轉染對照組比：aP＜0.05

3 討論

近年來隨著人們生活節奏的加快及飲食結構的改變，大腸癌在我國的發病率和病死率已經呈逐年上升的趨勢，發病率已躍居第3位，而病死率則位居惡性腫瘤死亡譜的第4位，并且有明顯的年輕化趨勢[5]。目前治療上主要以外科手術切除為主結合輔助放化療，以5-FU為基礎的術后輔助化療使淋巴結陽性的結腸癌患者的病死率有所降低，但是由結腸癌耐藥引起的復發和轉移仍然是進一步提高療效的主要障礙[6]，因此進一步研究大腸癌細胞對5-FU的耐藥機制、增強腫瘤細胞對5-FU化療的敏感性迫在眉睫。

HSP又稱應激蛋白，是指細胞在應激情況下所產生的一組序列高度保守的蛋白質，廣泛存在于原核和真核生物中，應激狀態下可被誘導表達。HSP27是小分子質量HSP亞家族的重要成員，目前國內外研究表明，其在肝臟、胃、結直腸等消化道腫瘤組織中異常高表達[7-9]，我們在前期研究中，已經證實HSP27在結腸癌細胞及裸鼠皮下移植瘤組織中呈高表達[10-11]。最近的蛋白組學研究表明，HSP27在結直腸癌中的過表達與化療耐藥和預后不良存在必然聯系[12]。Wang等[13]對62例結直腸癌外科手術后行5-FU為基礎化療患者進行了6年的隨訪研究，結果發現腫瘤組織中HSP27高表達的患者，其化療療效較差。本研究通過Western blot法檢測發現不同種類人大腸癌細胞中HSP27蛋白的表達水平存在一定差異，同時檢測了各細胞株對5-FU的敏感性，證實了大腸癌細胞中HSP27蛋白的表達水平與5-FU化療藥物耐藥存在必然聯系，通過直線相關性分析顯示各組細胞HSP27的表達水平與IC50值呈正相關性（R=0.959，P=0.041）。其中SW480細胞HSP27相對表達量最高，而對應的IC50值也越高，說明SW480細胞對5-FU出現明顯耐藥，應而在后續的實驗中我們選擇SW480細胞作為研究對象，通過RNA干擾抑制HSP27基因的表達，并初步探討沉默該基因對5-FU抗腫瘤作用的影響。

RNA干擾是指在真核細胞中引入雙鏈RNA分子從而導致具有序列同源性的基因產生特異性基因沉默的現象，該技術已成為分子生物學研究中最為活躍的熱點之一。目前國內外進行的RNA干擾試驗研究大部分是通過化學合成靶向某個基因序列的siRNA，通過特定的載體導入細胞內，最終達到沉默目的基因的過程。本研究中我們通過設計合成了3對針對不同靶點的HSP27小干擾RNA作為實驗組，同時合成FAM熒光標記的陰性轉染對照用于轉染條件的優化和轉染效率的檢測。激光共聚焦顯微鏡觀察其轉染效率在80%以上，表明通過LipofectamineTM2000載體轉染細胞的可行性，應用Real-time PCR及Western blot技術對各組細胞HSP27 mRNA及蛋白水平表達變化進行檢測，結果表明設計的3對序列中有兩對siRNA干擾序列能有效抑制HSP27的表達，其中以siRNA-c干擾效果最好，在mRNA和蛋白水平的抑制率分別為69.5%、57.9%，因而我們最終選擇了siRNA-c干擾序列進行RNAi實驗研究。我們將轉染終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA的SW480細胞培養12、24、36、48、60 h后，通過CCK-8試劑盒檢測，計算細胞存活率分別為96.43±6.51、94.37±5.82、94.01±6.21、92.53±7.48、89.11±5.47，與正常對照組比較差異無統計學意義，表明終濃度為100 nmol/L的HSP27 siRNA可抑制SW480細胞生長，但不顯著。進一步實驗研究發現HSP27 siRNA-c轉染的SW480細胞對5-FU的IC50明顯下調，說明抑制HSP27表達后，可明顯增加大腸癌細胞對化療藥物5-FU的敏感性，降低5-FU的治療濃度。

綜上所述，我們認為HSP27蛋白在大腸癌細胞中的高表達與人大腸癌的發生、發展及耐藥密切相關，大腸癌細胞中HSP27的表達與5-FU耐藥呈正相關，靶向HSP27的siRNA能有效抑制大腸癌SW480細胞HSP27蛋白的表達，抑制細胞生長，同時增強5-FU化療藥物的敏感性，該實驗研究為臨床上解決大腸癌細胞對5-FU化療耐藥基因靶向治療問題提供理論依據。

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（本文編輯：吳健敏）

Silencing gene of heat shock protein 27 increases the sensitivity to 5-FU in colorectal cancer cells

HUANG Chongjie, LIU Changbao, ZHENG Chenguo, CAI Mao.Department of Colorectal Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the relationship between the HSP27 expression level and the sensitization to 5-FU in different kinds of colon cancer cells, and then explore the effect of HSP27 gene down-regulated by siRNA interference, and the sensitive of 5-FU.Methods:The HSP27 expression level in different kinds of colon cancer cells were detected by Western blot, and the inhibition rates of different concentration of 5-FU were determined by CCK-8 method, then the relationship between the relative level and IC50of 5-FU was analyzed by Linear correlation.Three siRNA sequences targeted on special sequence of HSP27 gene were designed, All siRNAs were transfected by lipofectamine 2000.The transfection effciency was observed by laser confocal microscope.The expression of HSP27 was tested with qRT-PCR and Western blot analysis.Different concentrations of 5-FU were added to the cells, which were transfected with siRNA-HSP27 48 h before.Then, the inhibition rate was determined by CCK-8 after 24 h.Results: The correlation between the level of HSP27 expression and IC50were positive.Real-time PCR and Western blot revealed that two targeted HSP27-siRNA could effectively inhibit the mRNA and protein expression of HSP27.CCK-8 showed that the transfection of HSP27-siRNA can improve the sensitivity of SW480 to 5-FU and the IC50was downregulated signifcantly.Conclusion:The correlation between the level of HSP27 expression of colon cancer cells and IC50of 5-FU are positive.HSP27-siRNA leads to the effcient inhibition of HSP27 expression in SW480 cells, and increase the sensitization to 5-FU.

colorectal carcinoma; HSP27; 5-fuorouracil; RNA interference

R735.34

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.006

2014-08-07

溫州市科技局科研基金資助項目（Y20090436）。

黃崇杰（1987-），男，浙江溫州人，住院醫師，碩士。

劉長寶，主任醫師，碩士生導師，Email：405120@ 163.com。