鴉膽子素D對(duì)HPV16感染細(xì)胞株的作用及其可能機(jī)制

潘鎦鎦，鄭飛云，諸海燕，章圣輝，胡燕

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325015）

·論 著·

鴉膽子素D對(duì)HPV16感染細(xì)胞株的作用及其可能機(jī)制

潘鎦鎦1，鄭飛云2，諸海燕2，章圣輝2，胡燕2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，浙江溫州 325015）

目的：研究鴉膽子素D對(duì)高危型人類乳頭瘤病毒（HPV）16感染細(xì)胞的增殖抑制作用、促凋亡作用及其可能機(jī)制。方法：以人宮頸鱗狀上皮永生化細(xì)胞株（Ect1/E6E7）作為HPV16型感染的宮頸癌前病變的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?、5、10、15、30 μ mol/L的鴉膽子素D分別體外作用于細(xì)胞24、48、72 h，用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法測(cè)定細(xì)胞增殖活性改變；以1、5、10 μ mol/L的鴉膽子素D分別體外作用于細(xì)胞24、48、72 h后，Cell cycle staining solution檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)周期變化，Hoechst 33258細(xì)胞核熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡情況，Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。宮頸癌細(xì)胞株Caski含有完整的HPV16型E6、E7基因序列，以此作為陽性對(duì)照，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞內(nèi)HPV16 E6、E7基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果：鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞具有明顯的抑制體外增殖作用，MTT結(jié)果顯示抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性（P＜0.05）。經(jīng)1、5、10 μ mol/L鴉膽子素D體外作用48 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯于G1期。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)鴉膽子素D作用48 h后，細(xì)胞凋亡率分別為（6.25± 0.76）%、（20.21±1.32）%和（8.61±1.59）%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Hochest33258細(xì)胞核染色法顯示細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變。Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示Ect1/E6E7中HPV16 E6、E7 mRNA表達(dá)水平無明顯下降，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而Caski中HPV16 E6、E7 mRNA表達(dá)水平下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：鴉膽子素D能有效地抑制Ect1/E6E7細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能是通過抑制HPV16 E6、E7 mRNA表達(dá)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

人宮頸永生化細(xì)胞；鴉膽子素D；增殖；人乳頭瘤病毒16

宮頸癌是女性最常見惡性腫瘤之一，目前認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)性感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的必要條件。HPV病毒DNA通?？梢哉系剿拗骷?xì)胞DNA中編碼并表達(dá)E6、E7蛋白，在細(xì)胞癌變過程中起重要作用。鴉膽子素D（Bruceine D）是中藥鴉膽子中提取出的具有水溶性的三環(huán)四萜類化合物，是鴉膽子的主要成分。我們前期工作已證實(shí)了鴉膽子油乳對(duì)宮頸癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞具有抑制增殖、促凋亡作用[1-2]。本研究以鴉膽子素D為研究對(duì)象，以期明確鴉膽子素D對(duì)高危型HPV16感染細(xì)胞的作用及其可能的抗病毒作用的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株：人宮頸永生化鱗狀細(xì)胞株（Ect1/ E6E7）購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫編號(hào)為CRL-2614），人宮頸癌細(xì)胞株Caski購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫（美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫編號(hào)為CRM-CRL-1550）。

1.1.2 主要試劑：鴉膽子素D粉劑（20 mg/支，純度：高效液相色譜法≥98%，上海源葉生物科技有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國(guó)Sigma公司），Annexin V-AF488/PI凋亡試劑盒、Cell cycle staining solution（CCS01）試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司），Hoechst33258試劑（碧云天生物技術(shù)研究所），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Fermentas公司），Real-time PCR試劑盒（美國(guó)Bio-rad公司）。

1.1.3 主要設(shè)備：Hetus恒溫水浴箱、Beckman離心機(jī)、Olympas相差倒置顯微鏡、Forma二氧化碳培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀（FACS Calibur）、ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、Olympus熒光顯微鏡（CX41）、ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物配置：Ect1/E6E7、Caski細(xì)胞株在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μ g/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。鴉膽子素D粉劑加入二甲基亞砜（DMSO）溶液中溶解后，加入RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成10 mmol/L的鴉膽子素D溶液，-4 ℃避光保存，DMSO在溶液中的含量＜0.05%。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖活性：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。以終濃度為1、5、10、15、30 μ mol/L的鴉膽子素D作用Ect1/E6E7細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組不加藥物，作用24、48、72 h后，分別取出培養(yǎng)板，加入MTT 20 μ L，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μ L DMSO，置搖床上低速振蕩30 min，用ELX800酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490 nm測(cè)定吸光度值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（cell growth inhibition rate，CGIR）=1-A（實(shí)驗(yàn)組-空白組）/A（對(duì)照組-空白組）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Cell cycle staining solution檢測(cè)細(xì)胞周期：實(shí)驗(yàn)組Ect1/E6E7細(xì)胞用1、5、10 μ mol/L的鴉膽子素D作用，對(duì)照組不加藥，48 h后收集，PBS 洗2次，加入1 mL CCS01 Cell cycle staining buffer，避光孵育半小時(shí)后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，經(jīng)Modifit軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V-AF488/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：按5×104個(gè)/mL密度將Ect1/E6E7細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組和終濃度為1、5、10 μmol/L的實(shí)驗(yàn)組，作用48 h后收集細(xì)胞，按試劑盒程序常規(guī)染色，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)Cell Quest軟件分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Hoechst33258細(xì)胞核染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變：按1×104個(gè)/mL密度將Ect1/E6E7細(xì)胞接種于6孔板中，6孔板內(nèi)預(yù)先放入由多聚賴氨酸處理過的無菌蓋玻片（18 mm×18 mm）進(jìn)行細(xì)胞爬片。將5 μ mol/L的鴉膽子素D作用Ect1/E6E7細(xì)胞設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組Ect1/E6E7細(xì)胞僅加入培養(yǎng)液，作用48 h后，按試劑盒程序常規(guī)染色，置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。

1.2.6 Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞E6、E7 mRNA表達(dá)：分別收集經(jīng)1、5、10 μmol/L鴉膽子素D作用48 h后的Ect1/E6E7、Caski和對(duì)照組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察出現(xiàn)清晰集中的28S、18S、5S三條帶，且28S/18S約為2∶1，證實(shí)RNA制品完整，未被降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，調(diào)整RNA濃度為2 μ g/L。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。模板為：RNA 1 μ L，5×Buffer 4 μL，10 mol/L dNTP 2 μL，Rnase Inhibitor 1 μ L，Reverse Transcriptase 1 μ L，Random Primer 1 μ L，Water 10 μ L，反應(yīng)體系25 ℃ 5 min，42 ℃60 min，70 ℃ 5 min，一個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物置于-20 ℃保存。HPV16 E6引物序列（159 bp）：上游5’-GAACA GCAATACAACAAACCG-3’，下游5’-TCTGCAACAAGACATA CATCG-3’。HPV16 E7引物序列（245 bp）：上游5’-AT GGAGATACACCTACATTGC-3’，下游5’-TAACAGGTCTTCC AAAGTACG-3’。內(nèi)參GAPDH引物序列（251 bp）：上游5’-CCATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3’，下游5’-GCCA GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3’。引物均委托Invitrogen公司合成。Real-time PCR模板：2×mix 12.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L，cDNA 5 μ L，加水至25 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，51 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。設(shè)GAPDH內(nèi)參基因組、Caski陽性對(duì)照組、目的基因組以及2管空白對(duì)照組（由DEPC水代替cDNA）。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，方差齊性者多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞體外增殖活性的影響 MTT法檢測(cè)結(jié)果（見表1）顯示，在不同濃度鴉膽子素D體外作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且隨作用時(shí)間逐漸延長(zhǎng)，與同濃度組比較均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。可見，鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，并呈濃度和時(shí)間依賴性。

表1 不同濃度鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞體外增殖活性的影響（±s）

表1 不同濃度鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞體外增殖活性的影響（±s）

與同一時(shí)間對(duì)照組比：aP＜0.05；與同一濃度作用24 h比：bP＜0.05

2.2 鴉膽子素D對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)鴉膽子素D作用48 h后，Ect1/E6E7細(xì)胞G0/G1期比率上升，S期和G2/M期細(xì)胞比率下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期（見表2）；Annexin V-AF488/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，將晚期凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞（右上象限）及早期凋亡細(xì)胞（右下象限）合計(jì)為總體凋亡率（見表2、圖1），細(xì)胞凋亡率逐漸升高，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中5 μ mol/L時(shí)凋亡率達(dá)峰值。實(shí)驗(yàn)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 Hochest33258細(xì)胞核染色法檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，熒光微弱、呈彌散性，而經(jīng)5 μ mol/L的鴉膽子素D體外作用48 h后，細(xì)胞核致密、濃染，或呈碎塊狀的藍(lán)色熒光，如圖2中箭頭提示有染色質(zhì)固縮的凋亡細(xì)胞核改變，形成凋亡小體。

表2 鴉膽子素D體外作用48 h對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞周期及凋亡的影響（±s，%）

表2 鴉膽子素D體外作用48 h對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞周期及凋亡的影響（±s，%）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

圖1 不同濃度鴉膽子素D體外作用48 h對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 5 μmol/L鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7 48 h后細(xì)胞凋亡變化

2.4 鴉膽子素D體外作用對(duì)HPV16 E6、E7基因的mRNA表達(dá)影響 Real-time PCR法測(cè)定每組樣本中每一個(gè)基因的△Ct，然后計(jì)算出2-△△Ct（見表3）。經(jīng)1、5、10 μmol/L鴉膽子素D體外作用48 h后，隨藥物濃度增加，Ect1/E6E7細(xì)胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct無明顯增加趨勢(shì)，即藥物濃度的增加并不能抑制mRNA表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而Caski細(xì)胞中HPV16 E6、E7 mRNA的2-△△Ct隨藥物濃度增加而增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），即mRNA表達(dá)水平與鴉膽子素D的作用具有濃度依賴性，呈遞減趨勢(shì)。

表3 Real-time PCR技術(shù)測(cè)定不同濃度鴉膽子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct（±s）

表3 Real-time PCR技術(shù)測(cè)定不同濃度鴉膽子素D作用后E6、E7 mRNA的2-△△Ct（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05

3 討論

在之前的研究中，我們已經(jīng)證明了鴉膽子油乳對(duì)高危型HPV16感染細(xì)胞Ect1/E6E7、Caski具有抑制增殖作用[1-2]，并且具有下調(diào)HPV病毒癌基因E6、 E7 mRNA表達(dá)水平的作用。而國(guó)內(nèi)也有大量研究顯示鴉膽子油乳對(duì)肺癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌等具有抗腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用，可能是通過抑制DNA的合成，或直接破壞腫瘤細(xì)胞生物膜結(jié)構(gòu)，或增加對(duì)抗癌藥物的通透性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用等方式[3-9]。對(duì)于鴉膽子油乳在抗HPV治療中的相關(guān)研究，有國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道鴉膽子油對(duì)離體尖銳濕疣組織中HPV DNA有明顯的破壞作用，抑制病毒的正常復(fù)制擴(kuò)增。其機(jī)制可能與改變細(xì)胞膜通透性有關(guān)，細(xì)胞膜通透性增大使得藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度增加，從而產(chǎn)生殺滅或抑制病毒的效果，或直接抑制病毒DNA的合成[10]。

生殖道高危型HPV的持續(xù)性感染已被證實(shí)為宮頸癌的主要危險(xiǎn)因素之一。目前認(rèn)為，HPV16、HPV18、HPV31、HPV33等高危險(xiǎn)型HPV，易造成宮頸癌。HPV中的E6、E7基因及其產(chǎn)物E6、E7蛋白具有導(dǎo)致正常細(xì)胞癌變的作用[11-12]。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究[13-16]發(fā)現(xiàn)siRNA能通過抑制E6、E7 mRNA表達(dá)，使E6、E7蛋白表達(dá)減少，p53或pRb堆積，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，提示E6、E7可作為宮頸癌治療的靶基因。但HPV是嚴(yán)格的嗜上皮病毒，人是唯一宿主，現(xiàn)在暫無合適的體外培養(yǎng)模型。通過借助重組DNA技術(shù)，可將HPV的全基因或部分基因克隆到適當(dāng)載體中，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到各種永生化細(xì)胞系，從而得到各種腫瘤研究的體外細(xì)胞模型。本研究中的Ect1/E6E7作為高危型HPV16感染載體，是體外研究HPV在宮頸癌前病變發(fā)生過程中作用的理想模型。從抗病毒角度研究出發(fā)，我們發(fā)現(xiàn)鴉膽子素D有以下幾點(diǎn)作用及機(jī)制。

3.1 鴉膽子素D對(duì)HPV16亞型感染細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用 Ect1/E6E7細(xì)胞是具有永生化能力的宮頸癌前病變細(xì)胞株，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度鴉膽子素D體外作用，Ect1/E6E7細(xì)胞體外生長(zhǎng)和永生化狀態(tài)受到抑制，表現(xiàn)為作用濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng)，則細(xì)胞的體外生長(zhǎng)抑制作用越明顯。根據(jù)MTT法檢測(cè)結(jié)果，當(dāng)鴉膽子素D作用濃度為10 μ mol/ L甚至更高時(shí)，Ect1/E6E7細(xì)胞的增殖抑制情況趨于平臺(tái)期，因此我們?cè)诮酉聛淼膶?shí)驗(yàn)中，選取了鴉膽子素D的1、5和10 μmol/L濃度作為研究濃度。

3.2 鴉膽子素D可誘導(dǎo)和促進(jìn)HPV16亞型感染細(xì)胞的凋亡 研究發(fā)現(xiàn)，鴉膽子油乳在體外對(duì)某些宮頸癌細(xì)胞具有抑制作用，其機(jī)制可能為藥物誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡程序[3，15-16]。本課題之前的研究也證實(shí)了鴉膽子油乳對(duì)Ect1/E6E7細(xì)胞具有促進(jìn)凋亡作用[1-2]。鴉膽子素D作為鴉膽子油乳中的提取物，其藥物作用可能與之類似。Ect1/E6E7細(xì)胞因轉(zhuǎn)染HPV16 E6、E7基因使得細(xì)胞永生化，而實(shí)驗(yàn)中，Ect1/E6E7細(xì)胞在鴉膽子素D的體外作用下出現(xiàn)了與宮頸癌Caski細(xì)胞相似的生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，提示HPV16 E6、E7基因的表達(dá)可能收到抑制，也可能與細(xì)胞凋亡程序的誘導(dǎo)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過Hoechst33258染色法發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鴉膽子素D作用后Ect1/E6E7細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞核呈碎塊狀濃染，有凋亡小體出現(xiàn)，提示細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示，經(jīng)1、5及10 μ mol/L鴉膽子素D體外作用48 h的細(xì)胞凋亡率逐漸升高，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）?？梢?，鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7細(xì)胞可誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞體外增殖。

3.3 鴉膽子素D抑制HPV16亞型感染細(xì)胞體外增殖能力的作用機(jī)制 為進(jìn)一步探討鴉膽子素D對(duì)HPV16亞型感染細(xì)胞的體外增殖抑制與促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用是否與HPV16主要病毒癌基因E6、E7介導(dǎo)的細(xì)胞永生化機(jī)制被阻斷相關(guān)，本研究通過Real-time PCR法檢測(cè)各不同濃度鴉膽子素D體外作用Ect1/E6E7細(xì)胞48 h后HPV16E6與E7基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)中以Caski細(xì)胞作為陽性對(duì)照，設(shè)置空白對(duì)照組，結(jié)果顯示Caski細(xì)胞中E6、E7 mRNA下調(diào)明顯，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而Ect1/E6E7細(xì)胞中E6、E7 mRNA有下調(diào)，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)鴉膽子素D對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用可能是作用于病毒癌基因E6、E7，由于Ect1/ E6E7細(xì)胞內(nèi)HPV病毒拷貝量比Caski細(xì)胞低，因此表現(xiàn)出鴉膽子素D對(duì)Caski細(xì)胞有更明顯的下調(diào)E6、E7表達(dá)的作用；另一方面，Ect1/E6E7細(xì)胞具有永生化能力，但并不是惡性腫瘤細(xì)胞，而Caski細(xì)胞是嚴(yán)格意義上的癌細(xì)胞，兩者在癌基因的活化、抑癌基因的失活、表觀遺傳突變等分子方面應(yīng)該有很多不同，因此在對(duì)抗腫瘤藥物的敏感性上可能也存在差異，癌細(xì)胞可能對(duì)抗腫瘤藥物敏感性更高。細(xì)胞內(nèi)病毒定量檢測(cè)亦證實(shí)了Caski細(xì)胞E6、E7病毒拷貝量遠(yuǎn)高于Ect1/E6E7細(xì)胞。說明從癌前細(xì)胞到癌細(xì)胞是個(gè)量變到質(zhì)變的過程，當(dāng)E6、E7蛋白表達(dá)量達(dá)到一定程度時(shí)，正常細(xì)胞基因水平產(chǎn)生變異，導(dǎo)致細(xì)胞的惡變。

綜上所述，鴉膽子素D體外作用HPV16陽性細(xì)胞可能是通過下調(diào)其病毒癌基因E6、E7的表達(dá)，從而誘導(dǎo)和促進(jìn)HPV16亞型陽性細(xì)胞的凋亡，抑制病毒感染細(xì)胞的持續(xù)增殖。本研究從抗病毒角度探討了藥物對(duì)癌前病變細(xì)胞的作用機(jī)制，在抗高危HPV感染及治療與高危HPV感染密切相關(guān)的宮頸病變方面提出了新的研究方向。

[1]潘鎦鎦, 章圣輝, 胡燕, 等.鴉膽子油乳對(duì)宮頸永生化細(xì)胞體外增殖和凋亡的作用[J].中國(guó)婦幼保健雜志, 2013, 28 (5): 834-837.

[2]胡燕, 萬小潔, 潘鎦鎦, 等.鴉膽子油乳對(duì)HPV16亞型感染細(xì)胞的作用及機(jī)制研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(11): 1545-1551.

[3]羅小秀, 高曉光, 周隆.鴉膽子治療宮頸癌及其作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生, 2010, 48(9): 15-16.

[4]Liu JH, Qin JJ, Jin HZ, et al.A new triterpenoid from Brucea javanica[J].Arch Pharm Res, 2009, 32(5): 661-666.

[5]Pan L, Chin YW, Chai HB, et al.Bioactivity-guided isolation of cytotoxic constituents of Brucea javanica collected in Vietnam[J].Bioorg Med Chem, 2009, 17(6): 2219-2224.

[6]Yu YL, Lu Y, Tang X, et al.Formulation, preparation and evaluation of an intravenous emulsion containing Brucea javanica oil and Coix Seed oil for anti-tumor application[J].Biol Pharm Bull, 2008, 31(4): 673-680.

[7]劉暉杰, 許華, 寧四清.鴉膽子油乳注射液聯(lián)合DX方案治療晚期胃癌臨床研究[J].實(shí)用醫(yī)院臨床雜志, 2010, 7(6): 76-77.

[8]李烜, 吳華.鴉膽子油乳滴注液聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察[J].臨床肺科雜志, 2010, 15(2): 266-267.

The effect of Bruceine D on high-risk human papillomavirus 16 infected cell and its possible mechanism

PAN Liuliu1, ZHENG Feiyun2, ZHU Haiyan2, ZHANG Shenghui2, HU Yan2.1.Department of Gynecology and Obstetrics, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gynecology and Obstetrics, the Frist Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the Bruceine D’s (BD) effect on human papillomavirus (HPV) type 16 infected cell in vitro.Methods:The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5, 10, 15 and 30 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the anti-proliferation effect was measured with MTT colorimetric assay; The Ect1/E6E7 was cultivated with BD (1, 5 and 10 μmol/L) for 24, 48 and 72 h, the cell growth cycle change was measured with cell cycle staining solution, the morphologic changes of cell apoptosis stained with Hoechst 33258 in the Ect1/E6E7 cell line were observed under fuorescence microscope treated with BD at concentration of 5 μmol/L for 48 h.Flow cytometry of Annexin V-FITC/PI assay was used to evaluate the apoptosis rate of Ect1/E6E7 cell line treated with BD at different concentrations (1, 5 and 10 μmol/L) in vitro.Cervical cancer cells Caski which contain complete HPV 16 E6, E7 gene, as a positive control, by real-time quantitative PCR to detect the mRNA expression of HPV E6, E7 of those two cells treated with BD.Results: Immortalized human ectocervical Ect1/E6E7 cell line treated with BD showed obviously morphological changes, and with the prolongation of drug action and the increase of drug concentration, the morphological changes became more apparent.BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cell in dose-dependent and time-dependent manner (P＜0.05).Ect1/E6E7 cell growth cycle was stagnated in the G1 phase.Hochest fuorescence staining presented the Ect1/E6E7 cells nucleus appeared apoptotic morphological change, and apoptotic bodies can be observed.Flow cytometry showed the apoptosis rate were(6.25±0.76)%, (20.21±1.32)%, (8.61±1.59)%, respectively, after 48 hours cultured with 1, 5, 10 μmol/L of BD (P＜0.05).Real-time PCR results showed that after cultivating with 1, 5, 10 μmol/L BD for 48 h, the expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Ect1/E6E7 cell were decreased, but compared with the control group, the difference was not statistically signifcant (P＞0.05).The expression of HPV16 E6, E7 mRNA of Caski cell were decreased, the difference was statistically signifcant (P＜0.05) compared with the control group.Conclusion:BD can inhibit the proliferation of Ect1/E6E7 cells signifcantly, the possible mechanism may be associated with the expression decline of HPV16 E6, E7 mRNA, which promote cell apoptosis.

human immortalized cervical cell; Bruceine D; proliferation; apoptosis; human papillomavirus 16

R711.74

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.003

2014-05-20

浙江省中醫(yī)藥管理局科研項(xiàng)目（2011ZB089）。

潘鎦鎦（1986-），女，浙江溫州人，住院醫(yī)師，碩士。

胡燕，主任醫(yī)師，Email：hywjz123@sina.com。