丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的構建

李德周，段志良，郭江龍，王思娜，劉慧芳，王志斌，鐘曉芝，陳永平，文金生

（1.寧波市第二醫院 肝病科，浙江 寧波 315000；2.溫州醫科大學 蟲媒病毒研究所，浙江 溫州325035；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 感染科，浙江 溫州 325015）

·論 著·

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的構建

李德周1，段志良2，郭江龍2，王思娜2，劉慧芳2，王志斌2，鐘曉芝2，陳永平3，文金生2

（1.寧波市第二醫院 肝病科，浙江 寧波 315000；2.溫州醫科大學 蟲媒病毒研究所，浙江 溫州325035；3.溫州醫科大學附屬第一醫院 感染科，浙江 溫州 325015）

目的：構建丙型肝炎病毒（HCV）CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探討其體內免疫學效應。方法：基于我們前期從HCV中鑒定的4條HLA-A*0201限制性CTL（細胞毒性T細胞）表位（NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180），2條HLA-A*1101限制性CTL表位（NS3609-617和NS5b251-259），1條HLA-A*2402限制性CTL表位（NS5b382-390）和2條Th（輔助性T細胞）表位（P73-15和NS5A276-288），合成編碼串聯CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表達質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A；陽性重組質粒分別免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402轉基因小鼠，采用ELISPOT實驗和CTL殺傷實驗檢測小鼠脾細胞內單個CTL表位特異性T細胞的水平及其殺傷靶細胞的效應。結果：合成了含有Kozak序列和編碼Igκ信號鏈序列、7條CTL表位、2條Th表位的基因序列并順利克隆入了真核表達質粒。陽性重組質粒免疫三種轉基因小鼠后，采用ELISPOT實驗檢測到小鼠脾細胞內存在單個CTL表位特異性分泌IFN-γ的CTL，后者可殺傷負載單個CTL表位的脾細胞。結論：成功構建了可誘導CTL反應的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。

丙型肝炎病毒；細胞毒性T細胞；表位；DNA疫苗；小鼠

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）為單股正鏈RNA病毒，其基因組翻譯3個結構蛋白（C、E1和E2）和七個非結構蛋白（P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）。HCV感染既可引起急性肝炎，也可導致慢性肝炎、肝硬化和肝癌[1]。據估計，目前全球有1.8億人已感染了HCV。目前，針對丙型肝炎有效的治療方法有兩種：聯合使用聚乙二醇化干擾素-α和利巴韋林及聯合使用Simeprevir和Daclatasvir，但前者只能治愈不到50%的患者，而后者高昂的價格也限制了其在大部分患者中的應用。目前，研發有效的疫苗仍是防治HCV感染的關鍵。

大量研究表明，HCV特異性CTL（細胞毒性T細胞，活化的CD8+T細胞）反應對于控制HCV感染和清除靶細胞內HCV至關重要[2]。因此，基于CTL表位的新型疫苗是目前HCV疫苗研發的一個方向。在前期研究中，我們從HCV中鑒定出了7條分別受HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402限制的CTL表位[3-5]和2 條Th（輔助性T細胞，活化的CD4+T細胞）表位（尚未發表）。HLA-I類基因A基因座位的三個等位基因（HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402）在不同膚色、種族人群中總覆蓋率均超過80%。因此，含有上述三種分子限制的CTL表位的候選疫苗具有廣泛的人群覆蓋率，具有通用型。本研究擬基于我們前期鑒定的7條CTL表位和2條Th表位構建CTL-Th表位嵌合DNA疫苗，并基于HLA轉基因小鼠研究其誘導CTL反應的效應。

1 材料和方法

1.1 材料 委托上海強耀多肽生物公司合成我們之前鑒定的7條CTL表位[NS4B78-86（SMMAFSAAL），NS5A367-375（TVSSALAEL），C181-189（LLSCLTTPV），NS2172-180（VLQAGLIRV），NS3609-617（ITLTHPITK），NS5B251-259（QVIRSLTER），NS5B382-390（YYLTRDPTI）]，其純度均大于95%。真核表達質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A購自美國Invitrogen公司。限制性核酸內切酶Xba I和Hind I I I購自北京艾德來生物科技有限公司。小鼠IFN-γ ELISPOT（酶聯免疫斑點實驗）試劑盒購自荷蘭U-CyTech生物公司。CTL殺傷試劑盒（LDH釋放法）購自美國Promega公司。HLA-A*0201轉基因小鼠購自美國Jackson實驗室，HLA-A*1101轉基因小鼠和HLA-A*2402轉基因小鼠購自美國Taconic公司。

1.2 CTL-Th表位嵌合基因的合成 委托北京六合華大基因科技股份有限公司合成編碼多個串聯CTL表位和Th表位的基因（已進行小鼠密碼子優化，命名為HCV-Meg），HCV-Meg基因片段從5’端到3’端分別為保護性堿基，Xba I酶切位點，Kozak序列，Ig κ信號鏈序列，編碼串聯的上述9條表位和1條廣譜性Th表位（PADRE表位，序列為AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（編碼表位的核苷酸之間為編碼連接橋的核苷酸），Hind I I I酶切位點和保護性堿基。

1.3 HCV-Meg克隆入真核表達載體 經Xba I和Hind I I I雙酶切并回收的HCV-Meg與經雙酶切處理并回收真核表達質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A在T4連接酶作用下連接，然后轉化入感受態大腸桿菌DH5α。培養已轉化的大腸桿菌后提取質粒，雙酶切處理質粒并采用1%瓊脂糖電泳。雙酶切正確的重組質粒送公司測序以確定重組質粒所攜帶的序列是否為完全正確的多表位串聯基因。經雙酶切處理并電泳和測序證明正確的陽性重組質粒[命名為pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg]用于免疫3種轉基因小鼠。

1.4 重組質粒免疫轉基因小鼠 重組質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg溶于PBS液至終濃度為1 mg/mL，分別用于免疫HLA-A*0201轉基因小鼠、HLAA*1101轉基因小鼠和HLA-A*2402轉基因小鼠。轉基因小鼠為6～8周齡，每種轉基因小鼠6只。50 μg重組質粒（溶于50 μL PBS）注射到小鼠脛骨前肌內，1周后，加強免疫2次（間隔1周）。第3次免疫1周后，頸椎脫臼法處死小鼠，制備脾細胞懸液。采用小鼠IFN-γ ELISPOT實驗檢測脾細胞內CTL表位特異性分泌IFN-γ的T細胞的水平。

1.5 小鼠IFN-γ ELISPOT實驗 采用小鼠IFN-γ ELISPOT檢測重組質粒免疫的轉基因小鼠脾細胞內CTL表位特異性分泌IFN-γ的T細胞的水平。簡述過程如下：將上述脾細胞濃度調整到5×106細胞/mL培養基，按照每孔100 μL的量加入預包被的ELISPOT 96孔板中并設置無肽孔（不加任何表位）和肽刺激孔（加入終濃度為20 μg/mL的不同的CTL表位）。ELISPOT板在37 ℃，5% CO2培養箱中培養24 h后，棄去每孔細胞液并洗滌每孔。每孔加入新鮮配制的生物素化的抗小鼠IFN-γ的檢測單抗，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鮮配制的HRP標記的鏈霉親合素，于37 ℃孵育1 h。洗板，每孔加入新鮮配制的顯色液，于37 ℃顯色20 h。采用自來水洗板以終止反應，采用ELISPOT讀板儀對每孔棕色斑點進行計數。每一個斑點代表1個斑點形成細胞（SFC），也可以說1個CTL表位特異性分泌IFN-γ 的T細胞。表位特異性T細胞的頻率表示為IFN-γ SFCs/5×105細胞。

1.6 準備靶細胞 處死未免疫的轉基因小鼠，制備脾細胞懸液，采用冰冷的枸櫞酸緩沖液（0.131mol/L枸櫞酸和0.666 mol/L磷酸氫二鈉，pH 3.2，4 ℃）處理脾細胞90 s，然后加入不同的CTL表位于37 ℃孵育2 h。最后，枸櫞酸處理的脾細胞和枸櫞酸處理并負載CTL表位的脾細胞作為靶細胞用于CTL殺傷實驗。

1.7 CTL殺傷實驗 CTL殺傷實驗[乳酸脫氫酶（LDH）釋放法]用于檢測重組質粒免疫小鼠的脾細胞殺傷未負載CTL表位及負載CTL表位的脾細胞的效應。按照試劑盒說明書，整個實驗在96孔圓底培養板中進行。來自重組質粒免疫小鼠的脾細胞用作效應細胞，枸櫞酸處理的脾細胞及枸櫞酸處理后并負載CTL表位的脾細胞作為靶細胞。實驗孔（Experimental）同時加入效應細胞和靶細胞，每孔靶細胞量固定為1×104細胞（50 μL培養基），設置3組效應細胞/靶細胞比率為10∶1，5∶1，1∶1。除了實驗孔，還設置了效應細胞自發釋放孔（ES）、靶細胞自發釋放孔（TS）、靶細胞最大釋放孔（TM）、容積校正孔（VC）和培養基背景孔（CM）。每孔總液體量為100 μL。在37 ℃孵育8 h后（第7.5小時，TM孔和VC孔加入10 μL細胞裂解液）。培養板于400×g離心4 min后，50 μL上清轉移到新的96孔板，加入檢測試劑，于37 ℃反應20 min。采用酶標儀測定液體490 nm的吸光度值。針對每個效/靶比，效應細胞對靶細胞的百分殺傷率計算公式如下：

1.8 統計學處理方法 采用SPSS 17.0統計學軟件。結果表示為mean±sD，Student t-test用于統計實驗組間的統計學差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 重組質粒結構圖 基于7條CTL表位和2條Th表位序列，合成了編碼串聯表位的CTL-Th表位嵌合基因（HCV-Meg）（經過小鼠密碼子優化）并擬克隆入真核表達質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A。9條表位信息見表1。HCV-Meg基因片段全長（含保護性堿基）為423 bp。如圖1-2所示：HCV-Meg基因片段從5’端到3’端分別為保護性堿基（ACA），Xba I酶切位點（TCTAGA），Kozak序列（GCCGCCACC），Ig κ信號鏈序列（ATGGGCATGCAGGTGCAGATCCAGAGCCTGTT CCTGCTGCTGCTGTGGGTGCCCGGCAGCAGGGGC），編碼串聯的上述9條表位和1條廣譜性Th表位（PADRE，AKFVAAWTLKAAA）的核苷酸序列（編碼表位的核苷酸之間為編碼連接橋的核苷酸），Hind I I I酶切位點（AAGCTT）和保護性堿基（TGT）。編碼的串聯表位之間的連接橋分別為“A”、“K”、“N”、“NA”、“G”、“NA”。

2.2 重組質粒雙酶切電泳圖 采用Xba I和Hind I I I 對HCV-Meg和pcDNATM3.1/myc-His（-）A分別進行雙酶切，將回收的基因片段和質粒在T4連接酶作用下連接，然后將連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5α。培養轉化的大腸桿菌，提取質粒，采用Xba I和Hind I I I雙酶切質粒，酶切產物進行瓊脂糖電泳。如圖3所示，第1和第4泳道為核酸marker，第2泳道為重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，第3泳道為雙酶切重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A，很明顯，從重組的pcDNATM3.1/myc-His（-）A質粒中雙酶切出了1 條400 bp左右的條帶，與插入的目的條帶大小一致。

表1 前期鑒定的CTL表位和Th表位的信息

圖1 CTL-Th表位嵌合基因序列

圖2 重組質粒pcDNATM3.1/myc-His（-）A的圖譜

圖3 重組質粒雙酶切電泳圖

2.3 重組質粒測序圖 將上述經雙酶切初步驗證正確的重組質粒送蘇州金唯智生物科技有限公司測序，如圖4測序結果所示：重組質粒中插入的核苷酸序列與我們委托生物公司合成的CTL-Th表位嵌合基因序列完全一致，無堿基丟失、插入或突變。將雙酶切電泳和測序完全正確的陽性重組質粒命名為pcDNATM3.1/myc-His（-）A-HCV-Meg，并大量提取該質粒以用于后續研究。

2.4 ELISPOT結果 重組質粒pcDNATM3.1/myc-His （-）A-DENV1-Meg分別用于免疫HLA-A*0201轉基因小鼠、HLA-A*1101轉基因小鼠和HLA-A*2402轉基因小鼠。在最后一次免疫1周后，我們采用了ELISPOT實驗檢測了重組質粒免疫的小鼠脾細胞內是否有單個CTL表位特異性能分泌IFN-γ的T細胞。如圖5所示，重組表位免疫的小鼠體內有顯著高水平的表位特異性T細胞（脾細胞體外肽刺激孔與無肽刺激孔比較差異有統計學意義，P＜0.05）。在重組質粒免疫的HLA-A*0201轉基因小鼠脾細胞中NS4B78-86，NS5A367-375，C181-189，NS2172-180特異性分泌IFN-γ的T細胞的頻率分別為56±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞，86±9 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞，45±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞，62±7 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞；在重組質粒免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠的脾細胞中NS3609-617，NS5B251-259特異性分泌IFN-γ的T細胞的頻率分別為34±9 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞和14±6 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞；在重組質粒免疫的HLA-A*2402轉基因小鼠脾細胞中NS5B382-390特異性分泌IFN-γ的T細胞的頻率為43±4 IFN-γ SFCs/5×105脾細胞。

2.5 CTL殺傷結果 如圖6所示，重組質粒免疫的小鼠的脾細胞可特異性殺傷負載單個CTL表位的脾細胞，其百分殺傷率與效應細胞和靶細胞的比率成正比。當效靶比為10∶1時，重組質粒免疫的小鼠的脾細胞對負載NS4B78-86、NS5A367-375、C181-189、NS2172-180、NS3609-617、NS5B251-259、NS5B382-390的脾細胞的百分殺傷率分別為（15.12±5.23）%、（22.63±7.76）%、（14.08±4.93）%、（20.95±6.75）%、（8.41±3.98）%、（6.28±3.21）%、（13.47±4.23）%。

3 討論

目前，丙型肝炎的危害依然非常嚴重。因此，開發防治性疫苗仍是目前丙型肝炎的研究熱點。考慮到CTL在防治丙型肝炎中發揮重要作用，基于高度保守的CTL表位的新型疫苗（尤其是DNA疫苗）非常具有吸引力。在前期的大量原創性研究中，我們從HCV中鑒定了7條高度保守的受HLA-A*0101、HLAA*1101、HLA-A*2402限制的CTL表位和2條Th表位。因此，基于上述表位的疫苗（尤其是CTL-Th表位嵌合DNA疫苗）具有潛在的應用價值。

圖4 重組質粒的測序圖

圖5 重組質粒免疫HLA轉基因小鼠誘導表位特異性T細胞反應

圖6 重組質粒免疫HLA轉基因小鼠誘導表位特異性CTL反應

大量研究已證實CTL-Th表位嵌合DNA疫苗可誘導更廣泛的免疫反應，而且誘導的反應也強于全蛋白疫苗。但該類疫苗能否誘導免疫反應取決于多個因素：編碼表位的基因能否啟動表達，表達的串聯表位能否進入內質網，串聯表位能否被宿主的蛋白酶體裂解并釋放出單個表位。目前對于此類疫苗的構建模式已形成共識，即該DNA疫苗中應攜帶Kozak序列，Ig κ鏈信號序列，編碼廣譜性Th表位（PADRE）的基因序列，編碼單個表位的序列之間由編碼連接橋的序列相連。因為Kozak序列能啟動基因表達，并能增強多個CTL表位表達的準確性和效率[6]。Ig κ鏈信號序列則可介導編碼的串聯CTL表位進入內質網進而進行了內源性抗原的HLA-I類分子加工途徑[7]。研究表明廣譜性Th表位（PADRE表位）輔助特異性免疫反應的發生，PADRE可增強疫苗的免疫效應，其對于T細胞表位疫苗研發不可或缺，PADRE的免疫原性強于普通的T細胞表位[8]。多個CTL表位的排列直接影響單個CTL表位能否釋放出來并誘導CTL反應，研究表明在CTL表位間引入連接橋不但有助于單個CTL表位的加工和釋放，而且不會導致新的CTL表位的產生[6]。因此，為了更好設計HCV多表位DNA疫苗，我們充分考慮了我們鑒定的9個表位的排列順序以實現：①蛋白酶體只在每個表位的羧基端裂解；②不產生新序列的肽段。并且我們采用兩種蛋白酶體裂解軟件預測肽的加工[9]以確保我們構建的DNA疫苗編碼的串聯表位能被小鼠蛋白酶體加工釋放出單個表位。密碼子優化有助于基因在選定宿主中高效表達，我們也相應地對所構建的串聯表位基因進行了小鼠密碼子優化。本研究中，我們嘗試構建了能編碼上述表位的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并采用HLA轉基因小鼠探討了其誘導免疫反應的能力。結果，我們發現本研究所構建的DNA疫苗免疫HLA轉基因小鼠后可誘導單個CTL表位特異性的CTL反應。這說明此DNA疫苗可在小鼠組織內表達串聯表位，后者可被小鼠蛋白酶體切割釋放出單個的CTL表位進而誘導CTL反應。

近年來，國內外研究人員曾嘗試構建了HCV的CTL表位串聯DNA疫苗[10-12]，并證實了此類疫苗可誘導CTL反應。與他們的研究相比，我們的研究具有以下特點：①我們構建的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗所編碼的CTL表位具有廣泛的人群覆蓋率，其總的人群覆蓋率可達到80%以上；②我們構建的疫苗編碼的CTL表位在HCV中具有高度保守性；③我們構建的疫苗可誘導針對所能編碼的所有單個CTL表位特異性的CTL反應。我們今后將進一步優化此DNA疫苗，使其能夠編碼更多的具有廣泛人群覆蓋率的CTL表位，并探討此類疫苗的免疫保護效應。

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（本文編輯：吳健敏）

Construction of hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine

LI Dezhou1, DUAN Zhiliang2,GUO Jianglong2, WANG Sina2, LIU Huifang2, WANG Zhibin2, ZHONG Xiaozhi2, CHEN Yongping3, WEN Jinsheng2.1.Department of Liver, the Second Hospital of Ningbo, Ningbo, 315000; 2.Institute of Arboviruses, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of Infection, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To construct hepatitis C virus (HCV) CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine and explore its in vivo immune response.Methods:Based on previously identified four HCV-specific HLAA*0201-restricted CTL (Cytotoxic T Lymphocyte) epitopes (NS4b_78, NS5a_367, C_181 and NS2_172), two HLA-A*1101-restricted CTL epitopes (NS3_609 and NS5b_251), one HLA-A*2402-restricted CTL epitopes (NS5b_382) and two Th epitopes (P73-15and NS5A276-288), the gene encoding chimeric CTL epitopes and Th epitopes was synthesized and cloned into eukaryotic expressing vector pcDNATM3.1/myc-His(-) A.The recombinant plasmid was used to immunize HLA-A*0201, HLA-A*1101 and HLA-A*2402 transgenic mice, ELISPOT and CTL cytotoxicity assay were used to measure the frequencies of CTL epitope-specifc T cells in splenocytes of mice and the cytotoxic activity of CTL against target cells.Results: The gene containing Kozak sequence and encoding Igκ chain signal sequence, seven CTL epitopes, two Th epitopes was successfully cloned into eukaryotic expressing vector.Recombinant plasmid immunization elicited epitope-specifc IFN-γ-secreting T cells which could lyse CTL epitope-pulsed splenocytes.Conclusion:A Hepatitis C virus CTL-Th epitopes chimeric DNA vaccine which can induce epitope-specifc CTL response is successfully constructed.

hepatitis C virus; cytotoxicity T lymphocyte; epitope; DNA vaccine; mice

R373.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.001

2014-10-11

國家自然科學基金資助項目（31070143）；浙江省自然科學基金資助項目（LY13H160035）；浙江省科技計劃項目（2014C33261）；寧波市科技計劃項目（2012A610247）。

李德周（1980-），男，浙江瑞安人，主治醫師，碩士。

文金生，副教授，碩士生導師，Email：wjs78@wmu.edu.cn。