中國小麥條銹菌分子標記技術的研發與應用綜述

謝曉麗，孫振宇，劉長仲

（1.甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅蘭州 730020；3.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070）

中國小麥條銹菌分子標記技術的研發與應用綜述

謝曉麗1，2，孫振宇3，劉長仲1

（1.甘肅農業大學草業學院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省植保植檢站，甘肅蘭州 730020；3.甘肅省農業科學院植物保護研究所，甘肅蘭州 730070）

概述了小麥條銹病早期定性、定量監測，介紹了小麥條銹菌種內特異性引物的設計及應用，主要包括小麥條銹菌生理小種的特異性標記開發和小麥條銹菌小種特異性引物的應用。

小麥條銹菌；監測預警；潛育期；早期檢測；生理小種；分子標記

小麥條銹病是我國小麥生產上的主要流行病害之一，曾造成小麥嚴重減產，對我國糧食安全造成嚴重威脅［1～2］。該病害在我國呈大區域流行的特點，其病原菌小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp.Tritici）為典型的專性寄生真菌，在我國大多病害發生區域并不能完成整個生活史中至關重要的越夏和越冬環節。陳萬權等系統分析了小麥條銹菌菌源傳播規律后發現，中國小麥條銹病存在兩大菌源基地，分別為秋季菌源和春季菌源，提出了病害源頭治理的策略［3］。目前化學藥劑的使用和抗病品種的推廣應用仍是我國小麥條銹病防控的主要手段［4～5］。早期監測預警是小麥條銹病綜合防控的首要環節，分子生物學技術在植物病害研究領域的應用，使病害的早發現、早診斷、早防治成為可能。另外由于小麥條銹菌的高變異特性，其生理小種的監測常作為對該病害流行預測預報及小麥抗病育種的重要依據之一。小麥條銹菌特異性分子標記的開發，以及各生理小種特異性分子標記的開發，都將大大提高小麥條銹病監測的準確率及防控的時效性，降低防控成本，對抗病育種工作產生重要影響。我們統計整理了我國小麥條銹菌及其生理小種的分子標記研究相關成果，及其在相關研究中的應用概況，以期為小麥條銹病的防控及抗病育種工作提供參考。

1 小麥條銹病早期檢測

1.1 小麥條銹菌的定性監測

根據外界環境條件不同，小麥條銹菌侵染小麥葉片后，需經過7～10 d左右的潛育期才可顯癥，因此小麥條銹病的早期監測對于小麥條銹病的防控尤為重要。小麥條銹病的早期監測是通過小麥條銹菌的特異性標記的開發來實現的（表1）。Zhao等根據小麥條銹菌的ITS序列，設計種特異性引物，反應體系中小麥條銹菌DNA量達到0.1 pg即可檢測［6］。Cao等根據小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設計兩對小麥條銹菌的特異性引物，其中引物組合YR（f）/YR（r1）可在小麥條銹菌侵染2 d的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA［7］。Wang等設計特異性引物并優化試驗體系，其檢測靈敏度達到10 pg，可在溫室接種及田間采集的小麥葉片中檢測到潛育期的小麥條銹菌，實現對小麥條銹病的早期檢測，并申請專利［8～9］。為提高小麥條銹菌分子檢測的靈敏度，在前期工作基礎上，根據小麥條銹菌的PSR序列設計引物，利用巢式PCR反應監測小麥條銹菌，其靈敏度可達1 fg，可在接種24 h后的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌的侵入［10～11］。為了簡化小麥條銹菌監測的步驟，Sun等設計了2對小麥條銹菌特異性引物并優化反應體系，利用單管巢式PCR反應，使小麥條銹菌檢測的靈敏度達到20 fg，可在接種24 h的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA，并申請發明專利［12～13］。Huang等根據小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設計引物，利用Loop-Mediated Isothermal Amplification（LAMP）技術實現僅通過反應體系顏色的變化來檢測小麥條銹菌侵入的目的，并且其檢測精度達到2 pg，在接種24 h的小麥葉片中也可檢測到小麥條銹菌的侵入［14］。

小麥條銹病的早期檢測技術主要還是應用于研究中。孔新宇等通過將冬前定點的小麥植株移栽到溫室觀察和熒光定量PCR方法，分別分析了甘肅省小麥條銹菌的潛育越冬情況，驗證了小麥條銹菌在甘肅隴南和隴東地區越冬的可能性，并分析認為，熒光定量PCR方法較觀察法更為準確，也進一步說明小麥條銹病的早期檢測的可行性［15］。

表1 小麥條銹菌特異性引物序列

1.2 小麥條銹菌的定量監測

定量PCR技術為實現小麥條銹菌的定量監測提供了技術支持。潘娟娟等根據小麥條銹菌β-微管蛋白基因序列設計特異性引物，利用Real-time PCR可在接種12 h的小麥葉片中檢測到小麥條銹菌DNA，并建立小麥條銹菌的早期定量測定方法［16］。依據所建立的小麥條銹菌早期定量測定方法，潘娟娟定義并測定了分子檢測病情指數MDX，根據其與實際發病最終病情指數DX關聯性建立預測方程，通過甘肅和北京兩地試驗田塊定點取樣初步驗證小麥條銹菌早期定量監測的可行性［17］。閆佳會等應用潘娟娟等建立的小麥條銹菌早期定量測定方法，建立了分子病情指數（molecular-detected disease index，MDI）與田間發病病情指數（disease index，DI）之間的回歸模型，進一步驗證了小麥條銹菌早期定量監測的可行性及其在小麥條銹病監測中的重要作用［18］。

2 小麥條銹菌種內特異性引物的設計及應用

2.1 小麥條銹菌生理小種特異性標記的開發

研究表明，小麥品種抗性一般在3～5 a即被小麥條銹菌所克服而喪失抗性［3］，這與小麥條銹菌的高變異特性有關，因此小麥條銹菌生理小種的監測對于小麥育種及對小麥條銹病的流行預測具有重要意義。目前，我國小麥條銹菌的毒性變異監測主要靠觀測其在一系列鑒別寄主品種上的反應型來實現，小麥條銹菌生理小種的監測工作是通過田間標樣的采集、病原菌的純化繁殖、及其在一系列鑒別寄主上的反應型鑒定來完成的，鑒定工作需要較長的周期和較高的專業及環境要求。因而小麥條銹菌生理小種快速鑒定技術的開發與應用就顯得尤為重要，快速檢測技術的建立是以小種特異性標記的開發為前提的。

曹麗華等研究得到條中31號等4個生理小種的RAPD標記，證明了小麥條銹菌生理小種分子檢測的可行性［19］。康振生等利用條中29號特異性RAPD標記轉化得到該小種的1對SCAR標記［20］，曹麗華等、張勃等、郝保軍等、仲軍和胡小平等先后得到了條中31號、條中32號、條中33號及條中17號等當時主要流行小種的SCAR標記［21～25］（表2）。這些分子標記的建立，填補了我國小麥條銹菌生理小種研究中的空白，為小麥條銹菌生理小種的分子鑒定工作提供了可能，其完善及應用將大大提高我國小麥條銹菌生理小種監測的效率。

2.2 小麥條銹菌小種特異性引物的應用

李進斌等應用5個小麥條銹菌主要流行小種的特異性標記，分析了云南省2個縣的小麥條銹菌群體，結果表明，條中29和條中32兩個生理小種特異性分子標記的檢出率最高，且單片病葉上能檢測到多個小種特異性標記［26］。李進斌等應用相同研究方法研究了不同栽培模式下小麥條銹菌群體的變化，結果表明品種混種可顯著降低相應優勢小種標記的檢出率，并有效減少單病葉中的小種數量［27］。這些研究結果表明，小麥條銹菌小種分子標記的應用拓寬了病原菌監測的研究領域，提高了小麥條銹菌群體分析的工作效率。

表2 小麥條銹菌生理小種特異性引物名稱及序列

3 結束語

病原菌的早期檢測對于病害防控尤其是流行性病害的防控意義重大。小麥條銹病屬于典型的氣傳病害，本地菌源作為初始菌源的區域，早期病原菌的陽性監測點即為該地發病中心，對于發病中心范圍內植株的藥劑治療和保護將有效的降低甚至消除發病隱患，有效控制當地的初始菌源數量，實現病害防控的X0策略。并且該地域往往作為小麥條銹病的菌源基地，病原菌的早期檢測防控也將有效降低其外傳菌源量，這些對于外來菌源作為初始菌源的區域有重大意義，因此小麥條銹菌菌源基地的界定對于小麥條銹病的防控至關重要。小麥條銹菌的早期檢測，為小麥條銹病越夏和越冬區域范圍的界定提供有力支持，有利于及時準確的防控，降低防控成本。

病原菌毒性變異監測對育種及品種布局有重要指導意義。當前小麥條銹菌的毒性變異監測工作繁瑣，需要大量人力物力的投入，而且易受人員經驗及外界環境因素的影響。分子標記的開發與利用將大大提高小麥條銹菌毒性變異監測的工作效率與準確度，其結果為育種工作指明了方向，同時也是利用品種布局來有效控制小麥條銹病的重要參考。然而小麥條銹菌生理小種繁多，且小麥條銹菌具高變異的特性，目前已定名的有條中1-33號，以及諸多的致病類群，但進行分子標記開發時，只能兼顧到當時的主要流行小種，不能很好的將所有生理小種進行區分，而且由于小麥條銹菌生理小種的復雜性，每個特異性標記所能代表的群體或者個體限制較大，現有的分子標記尚不能應用到小麥條銹菌生理小種的鑒定工作中，因此小麥條銹菌分子檢測體系還需隨著分子生物學技術的不斷發展而不斷完善。

［1］李振岐，曾士邁.中國小麥銹病［M］.北京：中國農業出版社，2002.

［2］WAN A M，CHEN X M，HE Z H.Wheat stripe rust in China［J］.Australian Journal of Agricultural Research，2007，58：605-619.

［3］陳萬權，康振生，馬占鴻，等.中國小麥條銹病綜合治理理論與實踐［J］.中國農業科學，2013，46 （20）：4 254-4 262.

［4］魯愛軍，趙多長，張升恒，等.天水市2005年小麥條銹病流行特點及綜合治理措施［J］.甘肅農業科技，2007（1）：36-38.

［5］趙多長.天水市小麥條銹病綜合治理的措施與經驗［J］.甘肅農業科技，2008（3）：45-47.

［6］ZHAO J，WANG X J，CHEN C Q，et al.A PCR based assay for detection of Puccinia striiformis f.sp.tritici in wheat［J］.Plant Disease，2007，91：1 669-1 674.

［7］CAO L H，XU S C，LIN R M，et al.Early molecular diagnosis and detection of Puccinia striiformis f.sp.tritici in China［J］.Letters in Applied Microbiology，2008，46 （5）：501-506.

［8］WANG X J，ZHENG W M，BUCHENNAUER H，et al. The development of a PCR-based method for detecting Puccinia striiformis latent infections in wheat leaves［J］. Eur.J.Plant Pathol.，2008，120：241-247.

［9］康振生，王小杰，鄭文明，等.小麥條銹病菌分子檢測方法：中國：CN1888886A［P］.2007-01-03.

［10］湯春蕾.小麥葉片上潛伏期條銹菌的巢式PCR檢測及小麥與條銹菌互作中相關激酶類基因的表達譜分析［D］.楊凌：西北農林科技大學，2008.

［11］WANG X J，TANG C L，CHEN J L，et al.Detection of Puccinia striiformis in latently infected wheat leaves by nested polymerase chain reaction［J］.Journal of Phytopathology，2009，157（7/8）：490-493.

［12］SUN Z Y，HUANG C，WANG H G，et al.Detection of latent infection of wheat leaves caused by Puccinia striiformis f.sp.tritici using single-tube nested PCR［J］. Phytopathology，2011，101（6）：173.

［13］馬占鴻，黃沖，孫振宇，等.2011.小麥條銹菌單管一步巢式PCR檢測方法及引物：中國，中國專利：CN102154485A［P］.2013-06-12.

［14］HUANG C，SUN Z Y，YAN J H，et al.Rapid and precise detection of latent infections of wheat stripe rust in wheat leaves using Loop-mediated Isothermal Amplification.［J］.Journal of Phytopathology，2011，159：582-584.

［15］孔新宇，馬麗杰，鄒一萍，等.甘肅省小麥條銹菌的潛育越冬研究［J］.麥類作物學報，2014，34（8）：1 141-1 145.

［16］潘娟娟，駱勇，黃沖，等.應用real-time PCR定量檢測小麥條銹菌潛伏侵染量方法的建立［J］.植物病理學報，2010，40（5）：504-510.

［17］潘娟娟.應用real-time PCR定量測定小麥條銹菌潛伏侵染的研究［D］.北京：中國農業大學，2010.

［18］閆佳會，駱勇，潘娟娟，等.應用real—time PCR定量檢測田間小麥條銹菌潛伏侵染的研究［J］.植物病理學報，2011，41（6）：618-625.

［19］曹麗華，康振生，趙杰，等.中國小麥條銹菌4個流行小種的RAPD標記［J］．西北農林科技大學學報（自然科學版），2004，32（7）：37-40.

［20］康振生，曹麗華，鄭文明，等.小麥條銹菌條中29號生理小種SCAR檢測標記的建立［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2005，33（5）：53-56.

［21］曹麗華，康振生，鄭文明，等.小麥條銹菌條中31號生理小種SCAR檢測標記的建立［J］.菌物學報，2005，24（1）：98-103.

［22］張勃，郝保軍，王保通，等.小麥條銹菌條中32號生理小種SCAR檢測標記的建立［J］.西北農林科技大學學報（自然科學版），2009，37（1）：177-181.

［23］郝保軍，王保通，李強等.小麥條銹菌水源11類群的RAPD分析及SCAR標記的建立［J］.植物病理學報，2010，40（1）：1-6.

［24］仲軍.小麥條銹菌流行生理小種RAPD標記分析及CYR33SCAR標記的建立［D］.蘭州：甘肅農業大學，2010.

［25］胡小平，魯傳強，馬麗杰.小麥條銹菌17號生理小種的分子檢測方法：中國，CN103555824A［P］. 2014-02-05.

［26］李進斌，蘭茗清，陳夢琪，等.利用小種標記分析云南省兩個縣的小麥條銹菌群體［J］.植物病理學報，2013，43（6）：643-646.

［27］李進斌，蘭茗清，楊進成，等.不同栽培模式對小麥條銹菌群體結構的影響［J］.云南農業大學學報，2014，29（1）：11-15.

（本文責編：楊杰）

Research and Application of Molecular Markers Technology of Puccinia striiformis in China

XIE Xiao-li1，2，SUN Zhen-yu3，LIU Chang-zhong1

（1.College of Prataculture Science，Gansu Agricultural University，Lanzhou Gansu 730070，China；2.Gansu Plant Protection Station，Lanzhou Gansu 730020，China；3.Institute of plant protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070）

In this paper，outlined an early qualitative and quantitative monitoring of the Puccinia striiformis f.sp.Tritici，introduced the design and application of species specific primer of Puccinia striiformis f.sp.Tritici fungus，mainly includes the development of the specific markers of physiological races of Puccinia striiformis f.sp.Tritici races，and application of the specific primers of Puccinia striiformis race.

Puccinia striiformis；Monitoring and early warning；Incubation period；Early detection；Physiological race；Molecular markers

Q943；S512.1

A

1001-1463（2015）05-0046-05

10.3969/j.issn.1001-1463.2015.05.015

2015-02-04

國家自然科學基金項目（31301605）部分內容

謝曉麗（1985—），女，甘肅民勤人，主要從事農作物病蟲害防治工作。聯系電話：（0）15682846257。E-mail：403325389@qq.com

劉長仲（1962—），男，重慶人，教授，主要從事昆蟲生態及害蟲治理研究。聯系電話：（0）13919179962。E-mail：liuchzh@gsau.edu.cn