直接稀釋-HPLC法快速測定鮮橙中的有機酸和VC

葛寶坤，李淑靜，婁婷婷，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

直接稀釋-HPLC法快速測定鮮橙中的有機酸和VC

葛寶坤，李淑靜*，婁婷婷，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

采用流動相（乙腈-磷酸鹽緩沖液，PH=2.3）為稀釋液，建立了樣品直接稀釋、高效液相色譜（HPLC）分離、二極管陣列檢測器（PDA）檢測，同時快速測定鮮橙中的酒石酸、VC、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸的可靠方法。該方法以保留時間（Rt）定性，外標法定量；7種組分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的濃度范圍內，標準曲線有良好的線性關系，相關系數大于0.999 5；樣品在0.2、0.5、5.0g/kg3個加標水平的平均回收率為92%～104%（n=10），相對標準偏差為1.1%～2.9%；方法的定性檢出限（LOD）為0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量檢出限（LOQ）為0.05 g/kg～0.2 g/kg。

直接稀釋法；HPLC；PDA；鮮橙；有機酸；VC

鮮橙營養豐富，富含VC和有機酸。VC又稱抗壞血酸，是人體必須的維生素之一，它有利于提高人體免疫力[1]，防止人體衰老，降低膽固醇等作用[2]，因此測定鮮橙中的VC的含量，對評價其營養價值具有重要意義；橙汁的品質不僅取決于鮮橙的出汁率、固形物、含糖量、含酸量等因素，還取決于鮮橙的口感及風味，由于有機酸的種類和含量是決定鮮橙風味、口感和品質的重要因素之一；另外，有機酸還具有抗癌、鎮痛等功能[3]，因此有機酸的分析測定對鑒定鮮橙的真偽、產地尤為重要，也為人們更好地選擇優質的鮮橙提供依據。因此分析測試鮮橙中的有機酸和VC，對確定其特征酸及其含量，建立鮮橙中有機酸和VC的指紋圖譜對鑒別鮮橙的真偽及其來源顯得尤為重要。液相色譜法同時測定鮮橙中有機酸和VC的方法未見報道，同時測定沙棘汁和酸棗中的有機酸和VC的文獻已有報道[4-6]，上述文獻或存在僅靠色譜條件不能將VC與D-蘋果酸很好地分離而造成蘋果酸的測定結果偏高，或采用較為繁瑣的2次進樣分別測定有機酸和VC。目前，測定有機酸和VC的方法主要有滴定法[7-8]、分光光度法[9]、離子色譜法[10]、氣相法[11-12]、氣質法[13-14]、液相法[5，15-18]、液質質法[19]；滴定法僅適用于總酸的常量分析；比色法的精密度差、靈敏度低；氣相法和氣質法均需衍生和干燥，操作復雜且易破壞有機酸和VC，液質質法需要昂貴的設備。綜上，研究并建立了采用直接稀釋前處理、HPLC分離、PDA檢測器檢測、一次進樣可同時檢測鮮橙中的6種有機酸和VC的方法，該方法簡便、快速、靈敏、重現性好，可供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀：Waters公司，配2998型二極管陣列檢測器；MILLI-Q純水儀：MILLIPORE公司；HITACHI CR22G III型高速離心機。

1.2 試劑

乙腈：色譜純；磷酸：優級純，含量≥85%，天津化學試劑三廠；磷酸二氫鈉：優級純，天津永大化學試劑開發中心，含量≥99%；流動相：0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH=2.3）：乙腈=99∶1；混合標準儲備液的配制：準確稱取的酒石酸125mg、VC50mg、乳酸250mg、乙酸250mg、檸檬酸250mg、琥珀酸375mg、蘋果酸25mg標準品（均為CHEM SRVICE公司生產，含量均≥99.5%），用流動相溶解、混勻、定容，即為標準儲備液，標準使用液是將儲備液用流動相稀釋至所需要的濃度。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

鮮橙去皮，采用積壓方式取出橙汁，混勻，取橙汁1.0 g（精確至0.01 g）于15mL離心管中，用流動相直接稀釋定容至10mL，混勻，4℃、10000 r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜進液相色譜儀分析測定。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：迪馬公司，Diamonsil C8 250mm×4.6mm，5μm，或相當者；恒流速：0.6mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；波長：214 nm。

1.3.3 分析測定

根據樣液中被測組分的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液進行校正，Rt結合PDA光譜圖定性、峰面積定量，在色譜條件下，標準色譜圖、樣品色譜圖及待測組分的保留時間見圖1。

1.3.4 實際樣品檢測

對來自四川、云南、湖北、重慶、江西、廣西、福建七個產地的冰糖橙、錦橙、血橙、伏令夏橙、早金甜橙、倫晚臍橙、耐濕臍橙等18個品種的鮮橙進行了有機酸和VC的含量檢測。

2 結果與討論

2.1 流動相pH對分離效果的影響

研究了流動相的pH分別為1.8、2.0、2.3、2.5和3.0條件下對測定結果的影響，研究表明：當pH為1.8、2.0、2.3時，對分離效果的影響無顯著性差異，而當pH為2.5和3.0時，琥珀酸和蘋果酸不能實現很好的分離，同時考慮色譜柱的壽命和分離效果，本研究中磷酸鹽緩沖液的pH選擇2.3。

2.2 吸收波長的選擇

對有機酸最大吸收波長210 nm、214 nm和VC的最大吸收波長245 nm進行了對比研究，結果發現，有機酸在吸收波長214 nm和其最大吸收波長210 nm的響應值差別較小，而VC在214 nm吸收波長時的響應值比最大吸收波長245 nm時的響應值減少了3倍。但是，VC的檢測靈敏度是鮮橙中主要有機酸檸檬酸的5倍，因此，選取214 nm為本研究的最佳吸收波長。圖1為有機酸和VC的色譜圖。

圖1液相色譜圖Fig.1 LC chromatograms of the mixed standard solution（a）and sample（b）

2.3 方法的線性范圍和相關系數

用流動相將標準儲備液稀釋成質量濃度在0.02mg/mL～3.75mg/mL的范圍內，按照優化的色譜條件進行線性分析，以目標物峰面積為縱坐標（Y），以目標物質量濃度之比為橫坐標（X）繪制工作曲線，結果表明7種有機酸在0.02mg/mL～3.75mg/mL范圍內有良好線性關系，其相關系數均大于0.999 5，結果見表1。2.4 方法的回收率與精密度

表1 方法的靈敏度、線性關系及回收率（n=6）Table 1 Sensitivities，linear ships and recoveries of the method（n=6）

取鮮榨橙汁（按1.3.1操作）1 g（精確到0.01 g），按照0.2、0.5、5.0 g/L 3個加標水平進行加標回收試驗，結果為7種成分的平均回收率92%～104%（n=10），精密度小于2.0%，本方法的穩定性良好，結果見表1。

2.5 方法的測定限

按上述樣品制備方法取系列樣品，由高到底依次加入系列混合標液，按照本試驗方法和色譜條件分析測定，根據選擇合適的噪比S/N=10時的加標濃度計算本方法的定量限（LOQ）值，信噪比S/N=3時的加標濃度計算本方法的定性限（LOD）值，結果見表1。

2.6 方法的適用性

為了確定方法的抗干擾能力及適用性，分別選取鮮橙中常見的檸檬黃、日落黃，按照本方法條件進行添加干擾測試，結果顯示7種待測組分的色譜峰分離度和重現性均較好，符合分析方法的要求。

2.7 實際樣品測試

按照本研究方法，對來自四川、云南、湖北、重慶等8個產地的29個不同品種的鮮橙進行了有機酸和VC的檢測結果見表2。

VC的含量為0.2 g/kg～1.1 g/kg，酒石酸含量為0.2 g/kg～0.8 g/kg，檸檬酸為4.5 g/kg～21.9 g/kg，L-蘋果酸為0.4 g/kg～1.4 g/kg，僅有4個樣品檢出琥珀酸0.2 g/kg～0.3 g/kg采用本研究方法測得的結果與采用國標方法、行標方法測得鮮橙結果比較表明，二者的差別無顯著性，因此方法準確可靠，適用性較強。

表2 18種來自不同產地鮮橙中有機酸和VC的含量Table2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

續表2 18種來自不同產地鮮橙中有機酸和VC的含量Continue table 2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

3 結果

本研究的檢測方法7種待測組分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的濃度范圍內，有良好的線性關系，相關系數大于0.999 8；樣品在0.2、0.5、5.0 g/L 3個加標水平內的回收率范圍為92%～104%，6次測定的相對標準偏差為1.1%～2.9%；方法的定性檢出限（LOD）為0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量檢出限（LOD）為0.05 g/kg～0.20 g/kg，符合色譜分析的方法要求。本研究方法具有操作簡單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱和昂貴的質譜設備等特點，可供參考。

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The Method of Rapid Determination Tartaric Acid，VCby Direct Dilution-HPLC in Fresh Orange

GE Bao-kun，LI Shu-jing*，LOU Ting-ting，ZHENG Wen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method was developed for simultaneous determination of tartaric acid，vitamin C，lactic acid，acetic acid，citric acid，succinic acid，and malic acid in fresh orange.The sample was diluted directly by mobile phase（acetonitrile-NaH2PO4buffer solution，pH=2.3），and then analyzed by high-performance liquid chromatography（HPLC）with diode array detector（PDA）.The method for qualitative analysis was based on retention time.And external standard method was used for calculation.Good linear relationship was achieved in the range of 0.02 mg/mL-3.75 mg/mL for the 7 components with correlation coefficients above 0.999 5.The recoveries of the method ranged from 92%to104%（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）among 1.1%-2.9%at3 spiked levels of 0.2，0.5，5.0 g/kg.The limit of detection （LOD）of this method is among 0.02 g/kg-0.05 g/kg for the 7 components，while the limit of quantification （LOQ）was0.05 g/kg-0.2 g/kg for the7 components.This is a simple，rapid，sensitive method for detection of organic acid and VC.

directdilution；HPLC；PDA；fresh orange；organic acid；VC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.023

2014-10-23

國家質檢總局公益性行業科研專項（201310146）

葛寶坤（1968—），男（漢），研究員，本科，研究方向：殘留分析與食品添加劑檢測技術。

*通信作者：李淑靜，高級工程師，博士。