胡蘿卜多糖降低血糖的功能研究

闞國(guó)仕，楊艷俠，陳紅漫，任大明，盧鐸，趙迪

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

胡蘿卜多糖降低血糖的功能研究

闞國(guó)仕，楊艷俠，陳紅漫，任大明，盧鐸，趙迪

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110866）

探索胡蘿卜多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響以及作用機(jī)理。對(duì)正常小鼠尾靜脈注射四嘧啶建立糖尿病小鼠模型，采用格列本脲和不同劑量的胡蘿卜多糖溶液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射。小鼠體內(nèi)藥理學(xué)研究顯示胡蘿卜多糖能顯著降低糖尿病小鼠空腹血糖和糖化血紅蛋白含量，增加小鼠肝糖原含量。胡蘿卜多糖能降低糖尿病小鼠血糖水平，同時(shí)增加糖尿病小鼠肝糖原含量，由此推斷其降糖機(jī)制可能與體內(nèi)的糖異生作用有關(guān)。

胡蘿卜多糖；降血糖；糖化血紅蛋白；肝糖原

胡蘿卜（carrot）又稱甘荀，屬傘形科二年生草本植物，以肉質(zhì)根作蔬菜食用，常見的根呈圓柱狀和圓錐狀，顏色多為橘黃色、白色、黃色和紫色。胡蘿卜具有益肝明目、利膈寬腸、健脾除疳等功效。最新研究發(fā)現(xiàn)胡蘿卜中含有的多糖類化合物具有多種生物活性，比如抗氧化[1]、抗腫瘤、抗病毒、改善機(jī)體免疫等，已成為當(dāng)今新藥研究的方向之一，但有關(guān)胡蘿卜多糖降低血糖水平的相關(guān)研究卻鮮有報(bào)道。胡蘿卜多糖是胡蘿卜中一類水溶性多糖，是胡蘿卜重要的生理活性成分之一，是由許多單糖分子縮合而成的長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)，經(jīng)降解轉(zhuǎn)變成可溶性的單糖和寡糖等，本文對(duì)胡蘿卜多糖進(jìn)行了提取、分離、純化，探究胡蘿卜多糖的降血糖功效并推測(cè)其可能的降糖機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮胡蘿卜：購(gòu)于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)院內(nèi)蔬菜市場(chǎng)；昆明種系小白鼠（雌雄兼用，體重30 g左右）：購(gòu)于北京實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心。

四氧嘧啶：美國(guó)Sigma公司；格列本脲：北京太洋藥業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；95%乙醇、氯仿、正丁醇均為國(guó)產(chǎn)分析純。

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；RE-85Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、DHL-A電腦恒流泵、DBS-100電腦全自動(dòng)部分收集器：上海青浦滬西儀器廠；LGJ-10型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；Sorvall高速冷凍離心機(jī)：凱特試驗(yàn)儀器公司；三諾安穩(wěn)血糖儀：三諾公司；UNIC7200型可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 熱水浸提法提取[2]胡蘿卜多糖

將購(gòu)買的新鮮胡蘿卜清洗干凈，切成細(xì)絲，50℃烘干，碾磨粉碎，40目過篩；稱取適量胡蘿卜干加5倍體積乙醇，50℃水浴除色素2 h，紗布過濾，棄上清液；濾渣按料液比1∶30加入蒸餾水，60℃水浴浸提8 h，重復(fù)浸提3次；合并3次所得濾液，進(jìn)行抽濾；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至原來體積的20%；4 500 r/min離心15min；上清液加5倍體積乙醇沉淀24 h；3 500 r/min離心30min，收集沉淀，冷凍干燥，得胡蘿卜粗多糖。

1.2.2 木瓜蛋白酶+Sevage法去除雜蛋白[3-4]

配制1%的粗多糖溶液，加入5%木瓜蛋白酶，溫度60℃及pH5.0條件下酶解2 h。按照V（多糖溶液）∶V（氯仿）∶V（正丁醇）=25∶5∶1加入3種組分，劇烈攪拌20min，4 500 r/min離心15min。棄去中間白色沉淀和下層油狀液體，收集上清液，重復(fù)操作3次。所得上清液透析96h，醇沉，離心，冷凍干燥，得胡蘿卜精多糖。1.2.3 胡蘿卜多糖的純度鑒定與含量測(cè)定

分離純化后的多糖進(jìn)行紫外掃描，在260、280 nm處均無(wú)吸收峰，說明多糖中無(wú)蛋白質(zhì)、多肽及核酸等物質(zhì)。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度，得出回歸線方程y=0.005 9x+0.000 1（圖1），計(jì)算出胡蘿卜多糖的提取率為30%，見圖1。

圖1 苯酚-硫酸法測(cè)定葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose by phenol-sulfuric acid method

1.2.4 胡蘿卜多糖對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖抑制作用的研究

1.2.4.1 糖尿病小鼠模型的構(gòu)建與給藥途徑[5]

取體重30 g左右（30±1.0）的昆明種小鼠60只，雌雄同用，每天自由飲食飲水，常規(guī)喂養(yǎng)3 d，未發(fā)現(xiàn)有異常情況出現(xiàn)。尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（采血前禁食12 h），確定所有小鼠均屬于正常值范圍，隨機(jī)取10只作為正常對(duì)照組，剩下的小鼠均用來造模。各小鼠按照50mg/kg尾靜脈注射四氧嘧啶溶液（生理鹽水配成2.5%四氧嘧啶溶液），正常對(duì)照組小鼠注射等體積生理鹽水，同樣方法連續(xù)注射7 d，同時(shí)喂飼高脂高熱量飼料。血糖儀測(cè)定空腹血糖（GLU）≥7.0mmol/L，視為高血糖，同樣方法連續(xù)測(cè)定5 d，空腹血糖（GLU）≥7.0 mmol/L，視為糖尿病造模成功。造模成功的小鼠隨機(jī)分成5組，分別為胡蘿卜多糖高、中、低組，格列本脲組，四氧嘧啶致糖尿病模型組，以后所有小鼠均給予常規(guī)飼料，自由攝食飲水。

胡蘿卜多糖高、中、低劑量組每天分別按400、200、100mg/kg腹腔注射多糖溶液，陽(yáng)性對(duì)照格列本脲組按200mg/kg腹腔注射，四氧嘧啶模型組和正常對(duì)照組分別腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)注射8周。每周測(cè)量記錄各組小鼠的空腹血糖含量和體重。

1.2.4.2 標(biāo)本采集[6]

最后一次給藥后禁食12 h，血糖儀測(cè)定各組小鼠GLU后，引頸法處死小鼠，頸動(dòng)脈插管放血，分離血清，測(cè)定HbA1c的含量。取其肝臟，生理鹽水清洗至蒼白色，用濾紙吸干，稱取0.5 g，放入加有30%KOH溶液的試管中編號(hào)，沸水浴中煮20min使肝組織全部溶解，取出冷卻后，按1∶2（體積比）加入95%酒精。沸水浴中至沸騰，3 000 r/min離心10min。將各管內(nèi)溶解物分別定量轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，仔細(xì)混勻，按照苯酚-硫酸法測(cè)定肝糖原含量。

1.2.4.3 指標(biāo)的檢測(cè)方法

1）空腹血糖（GLU）測(cè)定：取尾靜脈血1滴，用三諾血糖儀測(cè)定。2）糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定：用離子交換高效液相色譜法。3）肝糖原含量（mg葡聚/g肝組織）計(jì)算：葡聚糖含量×25/0.5。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體型變化

模型構(gòu)建組小鼠連續(xù)注射四氧嘧啶后，呈現(xiàn)與對(duì)照組明顯不同的外在特征：食量增多，飲水增多，排尿次數(shù)增多，尿量增加，體型消瘦，體重下降，呈現(xiàn)糖尿病的明顯癥狀，表明糖尿病模型構(gòu)建成功，而正常對(duì)照組小鼠體重增加，動(dòng)作敏捷。

胡蘿卜多糖高、中、低劑量組每天分別按400、200、100mg/kg腹腔注射多糖溶液，陽(yáng)性對(duì)照格列本脲組按200mg/kg腹腔注射，四氧嘧啶模型組和正常對(duì)照組分別腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)注射8周。每周測(cè)量記錄各組小鼠的空腹血糖含量和體重。分別見表1表2。

小鼠體重的變化（表1）表明，建模成功的各組小鼠與正常對(duì)照組相比，體重顯著性下降（P＜0.05）。給藥4周后，與正常對(duì)照組相比，模型組體重顯著性降低（P＜0.05）；與模型組相比，格列本脲組，多糖高、中、低劑量組體重顯著性增加（P＜0.05）。給藥8周后，與正常對(duì)照組相比，模型組體重顯著性降低（P＜0.05）；與模型組相比，格列苯脲組，多糖高、中、低劑量組體重極顯著性增加（P＜0.01）；與正常對(duì)照組相比，格列苯脲組，多糖高、中劑量組體重?zé)o顯著差異。表明格列苯脲組，胡蘿卜多糖高、中劑量組溶液對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠體重減輕有恢復(fù)作用。

表1 胡蘿卜多糖對(duì)糖尿病小鼠體重的影響Table1 Infection on the weight of diabetic mice

表2 胡蘿卜多糖對(duì)糖尿病小鼠GLU的影響Table 2 Infection on the GLU of diabetic mice

2.2 小鼠血糖的測(cè)定

小鼠血糖的測(cè)定結(jié)果（表2）表明，建模成功后的各組小鼠與正常對(duì)照組相比，血糖存在極顯著性差異（P＜0.01），血糖值明顯升高。給藥2周后，與正常對(duì)照組相比，模型組血糖升高，差異極顯著（P＜0.01）；格列苯脲組，多糖高、中、低劑量組小鼠血糖顯著性降低（P＜0.05）。給藥4周后，與對(duì)照組相比，模型組血糖升高，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，格列苯脲組，多糖高、中、低劑量組血糖降低，差異極顯著（P＜0.01）。給藥8周后，與對(duì)照組相比，模型組血糖升高，差異極顯著；與模型組相比，格列本脲組，多糖高、中、低劑量組血糖明顯下降，差異極顯著（P＜0.01）；與格列本脲組相比，高劑量組血糖無(wú)顯著差異。其中高劑量組小鼠血糖水平下降最明顯，與對(duì)照組相比，無(wú)顯著差異，基本達(dá)到了正常水平。

2.3 小鼠糖化血紅蛋白以及肝糖原測(cè)定

1）糖化血紅蛋白（HbA1C）測(cè)定：用離子交換高效液相色譜法。2）肝糖原含量（mg葡聚/g肝組織）計(jì)算：葡聚糖含量×20/0.5。見表3。

給予糖尿病小鼠胡蘿卜多糖8周后（表3），與對(duì)照組相比，模型組小鼠糖化血紅蛋白含量明顯升高，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，格列苯脲組，多糖高、中劑量組糖化血紅蛋白極顯著降低（P＜0.01），低劑量組無(wú)顯著性差異；與多糖低劑量組相比，多糖高、中劑量組差異顯著（P＜0.05）。

與對(duì)照組相比，模型組小鼠肝糖原含量明顯降低，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，格列苯脲組，多糖高、中劑量組小鼠肝糖原顯著性升高（P＜0.01），低劑量組肝糖原含量無(wú)顯著性差異；多糖高、中劑量組與低劑量組相比肝糖原有顯著差異（P＜0.05），表明胡蘿卜多糖能增強(qiáng)肝臟對(duì)葡萄糖的處理，而且與多糖溶液的濃度有關(guān)。

表3 胡蘿卜多糖對(duì)糖尿病小鼠糖化血紅蛋白以及肝糖原的影響Table3 Infection on the HbAlc and liver glycogen of diabetic mice

3 結(jié)論

糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝疾病，可分為Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病，雖然均以血糖升高為特征，但是它們的發(fā)病機(jī)理卻不同。Ⅱ型糖尿病是胰島B細(xì)胞被破壞，導(dǎo)致胰島素分泌絕對(duì)不足[8]，其發(fā)病機(jī)制與免疫系統(tǒng)的異常有關(guān)而一直備受關(guān)注。目前的降糖藥物在治療糖尿病方面雖然有一定的療效，但是存在一定的局限性和不良反應(yīng)[9]，因此探索新的降糖藥物勢(shì)在必行。一般情況下，血液中多余的葡萄糖轉(zhuǎn)變成糖原貯存在肝臟和肌肉組織中，當(dāng)血糖下降時(shí)，糖原再生成葡萄糖，以維持血糖濃度的相對(duì)穩(wěn)定。據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道促進(jìn)糖異生作用降糖藥是當(dāng)今一個(gè)新的研究思路[10]。糖原的代謝在維持血糖的穩(wěn)定中起著重要的作用，一些多糖類化合物有促進(jìn)糖異生的功效[11]，有望降低空腹血糖水平。

本研究通過對(duì)昆明種系雄性小鼠腹腔注射四氧嘧啶，破壞胰島B細(xì)胞，導(dǎo)致胰島素分泌絕對(duì)缺乏或胰島素抵抗，從而成功誘導(dǎo)出糖尿病模型小鼠。對(duì)患病小鼠的體內(nèi)藥理學(xué)研究顯示，胡蘿卜多糖可以顯著降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠的空腹血糖水平和糖化血紅蛋白，其降低空腹血糖和糖化血紅蛋白水平與格列苯脲相當(dāng)，同時(shí)胡蘿卜多糖高，中劑量組小鼠肝糖原含量有顯著增加，表明胡蘿卜多糖可以促進(jìn)體內(nèi)肝糖原的合成。胡蘿卜多糖降低糖尿病小鼠空腹血糖水平，增加肝糖原的含量，由此可見，胡蘿卜多糖具有降血糖功效。

胡蘿卜多糖對(duì)糖尿病小鼠的影響是多方面的，但不管是降低血糖、糖化血紅蛋白，還是增加肝糖原等相關(guān)指標(biāo)最終均達(dá)到減輕病情，阻止或延緩相關(guān)并發(fā)癥出現(xiàn)的目的。我們推測(cè)其多種治療作用可能是通過抑制胰島B細(xì)胞凋亡或改善胰島B細(xì)胞功能，促進(jìn)糖異生作用而取得的。因此今后亦應(yīng)加強(qiáng)胡蘿卜多糖改善胰島素分泌缺陷和促進(jìn)糖異生方面的研究。

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Research on Hypoglycemic Effects of Carrot Polysaccharide

KAN Guo-shi，YANG Yan-xia，CHEN Hong-man，REN Da-ming，LU Duo，ZHAO Di
（College of Biological Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，Liaoning，China）

To study the impact as well as the mechanism of the carrot polysaccharides on blood glucose levels in type I diabetic mice．type I diabetes mouse model was established by injection of alloxan for normal mouse tail vein，the glibenclamide and different doses of carrots polysaccharide solution were injected by mice intraperitoneal．vivo pharmacology studies have shown that carrots polysaccharide can significantly reduce fasting glucose levels of diabetic mice，significantly increase the glycogen content of diabetic mice.carrots polysaccharide can reduce fasting glucose of alloxan-induced diabetic mice，its hypoglycemic mechanism may be relevant to the gluconeogenesis of body.

carrot polysaccharide；hypoglycemic；HbA1c；liver glycogen

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.031

2013-08-14

遼寧省教育廳基金資助（No.L2012238）

闞國(guó)仕（1971—），男（漢），副教授，碩士，主要從事酶制劑以及多糖生化方面的研究工作。