訶子及其炮制品對小鼠抗氧化性的研究

訶子及其炮制品對小鼠抗氧化性的研究

謝金炎，何 敏*，梁曉霞，李 雪，廖 禮

(四川農業大學動物醫學院，四川雅安 625014)

摘要[目的]對比不同訶子及其炮制品對小鼠抗氧化性的影響。[方法]小鼠灌胃給藥不同劑量的原藥訶子、茜草制訶子和白狼毒制訶子，然后測定小鼠血清中總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、單胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)的含量，同時測定小鼠肝臟中MAO、MDA和脂褐素(LF)的含量，并觀察肝臟的組織結構。[結果]訶子及其炮制品可以提高小鼠血清中T-AOC、SOD含量，降低血清及肝臟中MAO、MDA含量，同時也降低肝臟中LF含量，并對肝細胞有一定保護作用。[結論]訶子及其炮制品對小鼠有明顯的抗氧化作用。

關鍵詞訶子；炮制品；抗氧化

中圖分類號S567

基金項目四川省教育廳科研項目(13SZA0249，10ZB035)；四川省科技廳應用基礎計劃項目(2014JY0113)。

作者簡介謝金炎(1993- )，男，浙江紹興人，本科生，專業：動植物檢疫。*

收稿日期2015-08-18

Study on Antioxidation of Fructus Chebulae and Its Different Processed Products

XIE Jin-yan, HE Min*, LIANG Xiao-xia et al(College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014)

Abstract[Objective] To compare the influence of the antioxidation of Fructus Chebulae and its different processed products. [Method] The mice were given the different doses of Fructus Chebulae, Fructus Chebulae stir-baking with Rubia Cordifolia, Fructus Chebulae stir-baking with Euphorbia fischeriana Steud. Then blood serum were taken to detect the contents of the T-AOC, SOD, MAO and MDA. Liver were taken to detect the contents of the MAO, MDA and LF. At the same time, liver tissue made tissue slice. [Result] Fructus Chebulae and its different processed products can increase the contents of the T-AOC and SOD in mice’s blood serum, decrease the contents of the MAO and MDA in mice’s blood serum and liver, decrease the contents of the LF in mice’s liver, and made contributions to the liver’s protection. [Conclusion] Fructus Chebulae and its different processed products have the antioxidation to mice.

Key wordsFructus Chebulae; Processed products; Antioxidation

訶子(MedicineTerminaliaFruit)為使君子科植物，是一味清涼解毒的中藥，其果實中含大量的鞣質(占干重的1/3)，以及多糖、多酚等物質，被譽為“藏藥之王”[1]。鞣質具有強烈的自由基清除活性以及抗氧化活性。多糖與多酚等物質也能夠清除動物體內自由基，抑制一些過氧化損傷，起到抗氧化的作用[2]。訶子還具有一定的藥理價值，但訶子直接入藥則利用率低，不能完全發揮其功效，因此需要對訶子進行炮制。孫虹祥[3]研究表明通過炮制可明顯提高多種中藥中有效成分的溶出度，從而增強其藥理作用。訶子經過炒、煨等炮制后，鞣酸含量顯著增高，可增強其抗氧化作用。

茜草與白狼毒為天然的中草藥，均具有顯著的抗氧化作用。茜草中的主要成分茜草雙酯能保護異丙腎上腺素誘發的心肌缺血損傷，能夠顯著抑制自由基脂質過氧化作用，可以降低脂質過氧化物丙二醛(MDA)的產生，增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性[4]。楊柯等[5]研究表明狼毒大戟提取液可以明顯提高Lewis小鼠SOD、GSH-PX和CAT值，顯示了狼毒較好地提高機體抗氧化能力的作用。該試驗以訶子為研究對象，探究訶子的不同炮制方法及其抗氧化作用，對其藏醫特殊炮制品(茜草制訶子和白狼毒制訶子)進行較為深入的研究，探明訶子及其不同炮制品對小鼠的抗氧化性，以拓寬訶子的臨床應用范圍，優化訶子的特殊炮制工藝，從而促進民族藥品的開發和應用。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物。SPF小鼠體重為20 g±2 g，雌雄各半(購自成都達碩科技有限公司，合格證號SCXK(川)2008-24)。

1.1.2藥物。訶子購自四川成都荷花池中藥材市場(產地廣西壯族自治區玉林市)；茜草購自四川成都荷花池中藥材市場(產地四川省阿壩藏羌族自治州)；白狼毒購自茗居茶園(產地山東省煙臺市)。上述藥材均由四川農業大學生藥學范巧佳副教授鑒定為正品藥材，分別為君子科植物訶子(TerminaliachebulaRetz)、茜草科植物茜草(RubiacordifoliaL.)和大戟科植物白狼毒(EuphorbiafischerianaSteud)。

1.1.3試劑盒。總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒，批號20140626；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，批號20140621；丙二醛(MDA)試劑盒，批號20140626；單胺氧化酶(MAO)試劑盒，批號20140627；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，批號20140619；脂褐素(LF)試劑盒，批號20140628；以上試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2試驗方法

1.2.1訶子不同炮制品的炮制。

1.2.1.1訶子的茜草制法。將茜草燒成白灰，按照1∶3的比例注入麥酒，攪拌，以稀稠如同酪漿為度，在鍋中少許沸開，然后放入訶子(以被淹沒為度)，接著快速滅火，在鍋中浸泡1 d；第2天撈出訶子，在木臼中揉破，肉核分離；將訶子肉用蒸餾水刷洗3次，于50～70 ℃烘干[6]。

1.2.1.2訶子的白狼毒制法。取與訶子等重量的白狼毒，加水煎煮，榨取汁液，保存。將訶子放入此液中(淹沒)，浸泡3 d，浸泡期間不要攪動，3 d后取出訶子，剝開取出核，將訶子肉放入上述白狼毒液中，小火燒煮，煮至汁液全部滲入訶子而干涸，于50～70 ℃烘干[7]。

1.2.2藥品溶液的制備。取待測定樣品訶子、茜草制訶子、白狼毒制訶子各10 g，加水200 ml浸泡過夜，煎煮 2 h，過濾；濾渣加水200 ml浸泡過夜，煎煮1 h，過濾。合并2次濾液，濃縮至20 ml(0.5 g生藥/ml)，備用[8]。

1.2.3試驗分組與給藥。取昆明種SPF級小鼠110只，雌雄各半，隨機分為11組，每組10只，分別為空白對照組、維生素E膠丸組(54 mg/kg)、原藥訶子高劑量組(4 g生藥/kg)、茜草制訶子高劑量組(4 g生藥/kg)、白狼毒制訶子高劑量組(4 g生藥/kg)、原藥訶子中劑量組(2 g生藥/kg)、茜草制訶子中劑量組(2 g生藥/kg)、白狼毒制訶子中劑量組(2 g生藥/kg)、原藥訶子低劑量組(1 g生藥/kg)、茜草制訶子低劑量組(1 g生藥/kg)、白狼毒制訶子低劑量組(1 g生藥/kg)。分組之后先對小鼠進行一周的飼養觀察，若小鼠的精神狀態、運動狀態、食欲及飲欲等無異常，則可進行后續試驗。各給藥組按劑量灌胃給藥，空白對照組給予等體積生理鹽水，每天1次，連續14 d。末次給藥后1 h，各組動物每只眼眶采血2 ml，分離血清備用。采血后小鼠處死，每只小鼠取肝左葉部位大致相同的一小塊肝組織約0.5 cm3固定于Bone氏液中；再取小鼠肝臟右外葉，稱重，冰浴下研磨成10%的肝臟勻漿液，2 000 r/min離心10 min，取上清液備用[9]。

1.2.4肝臟組織形態學觀察。取Bouin氏液中固定24 h的肝臟組織，進行包埋，修塊，石蠟連續切片，切片厚度4 μm，HE染色，作組織切片觀察。

1.2.5測定生化指標。運用試劑盒測定血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的含量以及肝臟中MAO、MDA和LF的含量。

1.2.6統計學處理。試驗數據均由SPSS 15.0軟件統計，并用單因素方差分析試驗組與對照組均數間差異的顯著性。

2結果與分析

2.1訶子及其不同炮制品的不同劑量對小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量的影響對小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量進行測定，結果顯示(表1)，原藥訶子與訶子不同炮制品的不同劑量對小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的含量均有不同程度的影響。與空白對照組相比，原藥訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)的小鼠血清中T-AOC和SOD含量均顯著升高，而MDA含量均明顯降低；同時，原藥訶子組(4、2 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2 g生藥/kg)的小鼠血清中MAO含量也明顯降低；與同等劑量原藥訶子組比較，各試驗組小鼠血清中SOD、MAO和MDA的含量均無明顯的變化。

表1　訶子及其不同炮制品的不同劑量對小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA的影響

注：*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組相比差異極顯著(P<0.01)；△表示與同等劑量的原藥訶子相比差異極顯著(P<0.05)。

2.2訶子及其不同炮制品的不同劑量對小鼠肝臟中MAO、MDA和LF含量的影響對小鼠肝臟中MAO、MDA和LF的含量進行測定，結果顯示(表2)，原藥訶子與訶子不同炮制品的不同劑量對小鼠肝臟中MAO、MDA和LF的含量均有不同程度的影響。與空白對照組相比，原藥訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)肝臟中MAO與MDA含量明顯降低，原藥訶子組(4 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2 g生藥/kg)小鼠肝臟中LF含量明顯下降；與同劑量原藥訶子組比較，白狼毒制訶子中劑量組(2 g生藥/kg)小鼠肝臟中LF的含量明顯降低，其余各試驗組小鼠肝臟中MAO、MDA和LF含量均無明顯的變化。

2.3訶子及其炮制品對小鼠肝臟組織形態學的影響光鏡下可見，在空白對照組中，肝小葉結構完整(圖1a)，干細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，且干細胞大小正常，但肝小葉中央區的肝細胞可見大、中、小的空泡，肝細胞索結構較清晰(圖1b)；VE膠丸組，肝小葉結構完整(圖2a)，干細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，且肝細胞大小正常，肝細胞空泡變性情況較空白組輕(圖2b)；白狼毒制訶子組，肝小葉結構完整(圖3a1、b1、c1)，干細胞圍繞中央靜脈呈放射狀排列，且干細胞大小正常，肝細胞空泡變性情況最輕(圖3a2、c2)，其中白狼毒制訶子中劑量組(2 g生藥/kg)肝細胞只見較小的空泡，且肝細胞索結構清晰(圖3b2)；原藥訶子組和茜草制訶子組，肝小葉結構較完整(圖4a1、b1、c1，圖5a1、b1、c1)，肝細胞可見中、小的空泡(圖4a2、b2、c2，圖5a2、b2)，其中原藥訶子高劑量組(4 g生藥/kg)肝細胞索結構較亂(圖5c2)。

表2　訶子及其不同炮制品的不同劑量對肝臟中MAO、MDA和LF的含量影響

注：*表示與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組相比(P<0.01)；△表示與同等劑量的原藥訶子相比差異顯著(P<0.05)。

注：a.HE×100；b.HE×400。 圖1　空白組肝臟組織切片

注：a.HE×100；b.HE×400。 圖2　VE膠丸組肝臟組織切片

注：a 1、b 1、c 1為HE×100；a 2、b 2、c 2為HE×400。 圖3　白狼毒制訶子低(a)、中(b)和高(c)劑量組肝臟組織切片

3討論

3.1訶子及其不同炮制品的不同劑量對小鼠血清中T-AOC、SOD、MAO、MDA含量的影響T-AOC是用于衡量機體抗氧化系統功能狀況的綜合性指標，其大小可代表反應機體抗氧化酶系統和非酶促系統對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態。血漿T-AOC系統主要起防護氧化作用，它通過消除自由基、活性氧及分解過氧化物、阻斷過氧化鏈，以免引發組織細胞脂質過氧化[10]。SOD是機體清除自由基的主要酶，SOD活性的高低間接反映機體清除自由基的能力[11]。試驗中原藥訶子和訶子的不同炮制品與空白組T-AOC、SOD相比均有顯著升高，說明原藥訶子與訶子的不同炮制品可以使機體中的T-AOC、SOD升高，使機體的抗氧化能力提高，清除自由基，從而延緩衰老的進程。

單胺氧化酶(MAO)廣泛地分布于機體組織內，可以催化芳香族、脂肪族單胺類氧化脫氫基反應，同時，MAO也與衰老密切相關，當MAO活性增加，可能導致神經遞質紊亂，大腦生理功能退化等，而抑制MAO的活性，可以起到抗衰老的作用[12]。試驗中原藥訶子組(4、2 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2 g生藥/kg)與空白組MAO相比均有明顯降低，表明原藥訶子及不同炮制品(4、2 g生藥/kg)可以使機體中的MAO降低，起到抗衰老的作用。

丙二醛(MDA)是脂質過氧化的代謝產物，MDA含量可以反應機體脂質過氧化情況，間接反映機體細胞受損的程度[13]。如果MDA含量升高，表明機體脂質過氧化程度較高，機體細胞受損嚴重。試驗中原藥訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)的小鼠血清中MDA與空白組相比均有明顯降低，表明原藥訶子和訶子不同炮制品可以延緩脂質過氧化，保護組織細胞。

3.2訶子及其不同炮制品的不同劑量對小鼠肝臟中MAO、MDA和LF含量的影響試驗中原藥訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)小鼠肝臟中MAO與MDA含量與空白組相比明顯降低，表明原藥訶子和訶子不同炮制品可以減緩機體衰老，并保護肝細胞。

注：a 1、b 1、c 1為HE×100；a 2、b 2、c 2為HE×400。 圖4　茜草制訶子低(a)、中(b)和高(c)劑量組肝臟組織切片

注：a 1、b 1、c 1為HE×100；a 2、b 2、c 2為HE×400。 圖5　原藥訶子低(a)、中(b)和高(c)劑量組肝臟組織切片

脂褐素(LF)又稱老年斑，其含量與自由基含量呈正相關[14]。當肝臟中LF含量升高，表明機體內自由基含量增加。試驗中原藥訶子組(4 g生藥/kg)、茜草制訶子組(4、2 g生藥/kg)、白狼毒制訶子組(4、2 g生藥/kg)小鼠肝臟中LF的含量與空白組相比明顯下降，表明機體中自由基被清除，抗氧化能力有所提高。

3.3訶子及其炮制品對小鼠肝臟組織形態學的影響光鏡下觀察到白狼毒制訶子組(4、2、1 g生藥/kg)肝細胞中空泡變性程度與空白組相比明顯改善，表明白狼毒制訶子組對肝細胞具有一定保護作用，這與白狼毒制訶子組肝細胞中MDA含量明顯降低、具有保護肝細胞作用相對應。與空白組相比較，原藥訶子組(4g生藥/kg)肝細胞索結構較為混亂，表明原藥訶子組(4 g生藥/kg)對肝細胞有一定損失作用。

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