動態(tài)濁度法測定醒腦靜注射液中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素的含量

劉薇薇甘國峰

（1 江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2 無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 無錫 214028）

動態(tài)濁度法測定醒腦靜注射液中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素的含量

劉薇薇1甘國峰2

（1 江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122；2 無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司，江蘇 無錫 214028）

目的建立醒腦靜注射液中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素定量測定方法，以進行生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)控。方法采用動態(tài)濁度法，分別對醒腦靜注射液中間產(chǎn)品進行測定。結(jié)果醒腦靜一次蒸餾液及灌封樣品采用此法檢測時，無干擾；而二次蒸餾液采用此法檢測時，出現(xiàn)部分干擾。結(jié)論動態(tài)濁度法可用于醒腦靜一次蒸餾液及灌封樣品的細菌內(nèi)毒素測定。

醒腦靜注射液；中間產(chǎn)品；動態(tài)濁度法；細菌內(nèi)毒素

醒腦靜注射液是由麝香、冰片、郁金、梔子提取制成的注射劑，用于治療腦栓塞、腦出血急性期、顱腦外傷、急性酒精中毒病癥[1]，其工藝過程主要包括一次蒸餾、二次蒸餾、配液、灌封、滅菌等過程。

中藥注射劑安全性再評價要求，生產(chǎn)工藝過程中應(yīng)對中間產(chǎn)品的熱原（或細菌內(nèi)毒素）污染情況進行研究，并根據(jù)情況設(shè)置監(jiān)控點。醒腦靜注射液成品質(zhì)量標準熱原檢測為家兔法，由于其操作繁瑣費時，不適用于注射劑生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控。近年來，一些學者已進行該品種細菌內(nèi)毒素測定法代替家兔熱原檢測的研究，測定方法多為凝膠色譜法[2-7]，而凝膠法僅為限度檢查或半定量法[8]。為更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，本文研究采用動態(tài)濁度法對3種中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素的含量進行定量測定，并探討該方法運用于生產(chǎn)的可行性。

1 材 料

1.1 試劑：細菌內(nèi)毒素工作標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號150601-201174，160 EU/支），細菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，中國藥品生物制品檢定所，批號w2010-8，10毫升/支），動態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號1202022，1.25毫升/支，檢測范圍0.03～10 EU/mL）

1.2 檢測樣品：醒腦靜一次蒸餾液（批號120616-Q1，120617-Q1， 120618-Q1），醒腦靜二次蒸餾液（批號120616-Q2，120617-Q2，120618-Q2），醒腦靜灌封樣品（批號120616-Q3，120617-Q3，120618-Q3）。以上樣品均由無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司提供。

1.3 儀器：VersaMaxTM酶標儀（美國分子儀器公司），QL-901渦旋振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細菌內(nèi)毒素限值（L）：根據(jù)藥品細菌內(nèi)毒素限值的計算公式，L＝K/M；本品為注射劑，其K=5 EU/（kg·h）；本品每日最大用量20 mL，其M=0.3333 mL/（kg·h）；根據(jù)公式計算，醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素限值為15 EU/mL。

熱原的檢測劑量為2 mL/kg，細菌內(nèi)毒素限值為2.5 EU/mL，為更嚴格的控制細菌內(nèi)毒素，故將限值定為2.5 EU/mL。

2.2 標準曲線的可靠性試驗：將細菌內(nèi)毒素工作標準品用BET水稀釋成每1 mL含0.03、0.15、0.75、3.75 EU細菌內(nèi)毒素系列溶液。另取動態(tài)濁度法鱟試劑若干支，每支加入BET水，使其溶解。取0.1 mL細菌內(nèi)毒素系列溶液分別加到預先加有0.1 mL動態(tài)濁度法鱟試劑的96孔無熱原酶標板內(nèi)，混勻，立刻置VersaMaxTM酶標儀進行自動檢測，其中每一濃度重復3孔，并同時做陰性樣品3孔。

表2 醒腦靜3種中間產(chǎn)品干擾試驗結(jié)果及細菌內(nèi)毒素測定結(jié)果

其回歸方程為：lgT=2.79-0.424lgC，相關(guān)系數(shù) =0.990，其中C為細菌內(nèi)毒素濃度（EU/mL），T為平均反應(yīng)時間（s）；最低細菌內(nèi)毒素濃度λ=0.03 EU/mL，空白對照在規(guī)定檢測時間外，故細菌內(nèi)毒素標準曲線成立。具體結(jié)果見表1。

表1 標準曲線可靠性試驗結(jié)果

2.3 干擾試驗

2.3.1 供試品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計算：按MVD=L· C/λ1計算。L為醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素限值2.5 EU/mL，C為1.0 mL/mL，λ1為標準曲線的最低細菌內(nèi)毒素濃度0.03 EU/mL，計算MVD為83倍。中間產(chǎn)品的最大有效稀釋倍數(shù)同成品一致，最大稀釋倍數(shù)為83倍。

2.3.2 供試品干擾試驗：將中間產(chǎn)品用細菌內(nèi)毒素檢查用水依次稀釋為10、20、40、60、80倍溶液，作為供試品溶液；同時另取試管，進行同樣倍數(shù)稀釋，但其中需添加中點濃度（λm=0.75 EU/mL）的細菌內(nèi)毒素對照品溶液，作為含標準細菌內(nèi)毒素供試品溶液。分別取上述各液0.1 mL加到預先加有0.1 mL動態(tài)濁度法鱟試劑的96孔無熱原酶標板內(nèi)，混勻，立刻置VersaMaxTM酶標儀進行自動檢測，其中每一濃度重復2孔。按標準曲線線性回歸方程，計算供試品溶液及含標準細菌內(nèi)毒素供試品溶液的細菌內(nèi)毒素含量C1和Cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。

R＝（Cs－C1）/λm×100%

3種中間產(chǎn)品干擾試驗結(jié)果顯示，見表2，醒腦靜一次蒸餾液與醒腦靜灌封樣品在不同的稀釋倍數(shù)下，其細菌內(nèi)毒素回收率在50%～200%，認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾；且可在較低稀釋倍數(shù)下，進行日常檢測。醒腦靜二次蒸餾液細菌內(nèi)毒素回收率數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，120617-Q2在稀釋10倍～40倍時存在干擾，其他批次在此稀釋倍數(shù)下無干擾。

2.3.3 供試品細菌內(nèi)毒素含量測定：按照干擾試驗結(jié)果確定的稀釋倍數(shù)進行檢查，測定方法同干擾試驗。由標準曲線線性回歸方程計算每個樣品的細菌內(nèi)毒素濃度，單位為EU/mL。

3種中間產(chǎn)品細菌內(nèi)毒素測定結(jié)果顯示，見表2，其細菌內(nèi)毒素測定值均符合標準要求，即值＜2.5 EU/mL，與凝膠法測定結(jié)果一致。

3 討 論

醒腦靜一次蒸餾液及灌封樣品可采用低稀釋倍數(shù)進行細菌內(nèi)毒素控制。

從數(shù)據(jù)上看，不同批次的一次蒸餾液的細菌內(nèi)毒值均符合標準要求，但仍存在一定差異。其中一次蒸餾液120618-Q1是120616-Q1值的2倍。此結(jié)果提示生產(chǎn)過程中，與藥液接觸的工器具需清潔到位。

醒腦靜二次蒸餾液120617-Q2在稀釋10倍～40倍時存在干擾，其原因可能為該蒸餾液為芳香水，非均質(zhì)溶液，每批藥液存在一定差異。因此進行日常檢測時，可采用稀釋60～80倍后進行測定，同時需結(jié)合凝膠法綜合檢測分析。

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標準WS3-B-3353-98-2003[S].2003.

[2]匡翠蓮,王璐,張紅宇.醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素檢查法研究[J].中醫(yī)臨床研究,2012,4(2):114-117

[3]葉樹林,王曉蕾.鱟試劑檢查醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素的探討[J].軍醫(yī)進修學院學報,2011,32(5):469-470

[4]王新明,張斌.醒腦靜注射液內(nèi)毒素檢查法的可行性探討[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2003,19(1):114

[5]吳麗燕,張伽瑜.醒腦靜注射液中細菌內(nèi)毒素檢查法探討[J].新疆醫(yī)學,2001,31(3):231-232

[6]王梅娟,謝斌.醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素檢測方法的建立[J]. 中國醫(yī)藥導報,2008,5(34):12-13

[7]錢桂英.醒腦靜注射液細菌內(nèi)毒素檢測方法的研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2005,21(4):483-484

[8]國家藥典委員會.中國藥典2010年版(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:99-102.

Detection of Bacterial Endotoxin for Intermediates of Xingnaojing Injection by Kinetic Turbidimetric Assay

LIU Wei-wei1, GAN Guo-feng2
(1 School of Pharmaceutics, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 2 Wuxi Jiminkexin Shanhe Pharmaceutical Co. Ltd., Wuxi 214028, China)

ObjectiveTo establish the quantitative determination method of bacterial endotoxin in intermediates of Xingnaojing injection.MethodsIntermediates of Xingnaojing injection were detected by kinetic turbidimetric assay.ResultsThere was no interference during the detection process of the first distilled liquid and the filled and sealed samples. On the other hand, there was less interferences of the second distilled liquid.ConclusionThe method of kinetic turbidimetric assay is feasible to perform the bacterial endotoxin on the first distilled liquid and the filled and sealed samples of Xingnaojing injection.

Xingnaojing injection; Intermediates; Kinetic turbidimetric assay; Bacterial sendotoxin

R927.12

B

1671-8194（2015）08-0042-02