影響野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的相關因子研究

徐石蘭 岑秀芬 韋鵬霄李 彬 黃家達 李祖潭

（廣西大學農學院，南寧 530004）

野生毛葡萄是葡萄科葡萄屬真葡萄亞屬東亞種群的一個種，原產于中國。野生毛葡萄是廣西原產的野生葡萄資源中分布最廣、種類最多的一種［1］。我國野生葡萄分布有38種，占世界總葡萄種的60%，是野生葡萄資源最為豐富的國家［2］。孫馬等人對中國野生葡萄18個種和64個株系的染色體進行了研究，發現中國野生葡萄全部為二倍體（2n＝38）［3］。野生葡萄營養豐富，至少含有17種氨基酸，其中7種為人體必需的氨基酸，總糖含量、氨基酸含量、VB2含量、K含量較高［4］，還含有豐富的花色素雙糖苷、超氧化歧化酶及白藜蘆醇等物質，具有軟化血管、抗衰老、防癌的作用［4］。用野生葡萄釀造的野生葡萄酒，營養豐富，抗氧化活性和抗菌性高［5］。近些年來，國內有研究人員對野生葡萄的莖段、葉片、葉柄及單芽莖段等進行了離體培養研究［6］。劉偉對貴州成熟的毛葡萄種子用10%濃硫酸浸泡10min，萌芽率達100%［7］。到目前為止，還沒有報道對野生毛葡萄種子進行單因子和多因子的滅菌處理以及用不同的方法處理野生毛葡萄種子探究萌芽特性。所以，本試驗對廣西柳城縣野生毛葡萄種子的單因子和多因子的滅菌研究以及用不同方法處理野生毛葡萄種子探究萌芽特性，對野生毛葡萄離體繁殖和建立再生體系，對野生材料的大量繁殖、離體保存提高材料和技術支撐，為野生毛葡萄的遺傳轉化奠定理論和技術基礎。

1 材料與方法

1．1 材料

試驗材料為廣西柳城縣的野生毛葡萄種子，在2014年8月份葡萄成熟時采摘得到種子。

1．2 試驗設計與方法

1．2．1 0．1%升汞不同滅菌時間的比較試驗 本試驗通過同一濃度（0．1%）的升汞對野生毛葡萄種子處理不同的時間來測定滅菌時間對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響。滅菌時間依次為10min、12min、14min、16min、18min共5個處理。

1．2．2 兩種滅菌劑不同組合的比較試驗 為了比較75%酒精和0．1%升汞的組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響，設計4個處理組，即先用75%酒精分別處理10s、20s、30s、40s，然后再用0．1%升汞處理16min。

1．2．3 三種滅菌劑不同組合的比較試驗 為了比較75%酒精、不同濃度的升汞和次氯酸鈉的不同組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響，設計4個處理：（1）75%酒精30s＋0．1%升汞16min＋0．12%升汞5min；（2）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋0．15%升汞 5min；（3）75%酒精 30s＋0．1%升汞 16min＋12%次氯酸鈉 5min；（4）75%酒精30s＋0．1%升汞 16min＋15%次氯酸鈉5min。

1．2．4 不同預處理方法的比較試驗 為了比較溫水、赤霉素預處理對野生毛葡萄種子污染率和發芽率的影響，試驗設計如下：首先把野生毛葡萄種子放在冰箱在－4℃的低溫條件下保存40d，然后進行3組處理，即（1）低溫處理后不做任何處理；（2）低溫處理后把種子置于40℃的無菌水中浸2h；（3）低溫處理后把種子置于GA3 0．5mg/L（40℃）溶液中浸 2h。

以上各組試驗的每個處理均接種野生毛葡萄種子60粒，設三次重復。誘導培養基為：MS＋6－BA1．0mg/L＋GA3 0．3mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂6g/L。培養條件為：培養溫度25±1℃，光照強度1500LX，光照時間12h/d。對試驗數據采用SPSS方差分析軟件進行統計分析。

2 結果和分析

2．1 0．1%升汞不同滅菌時間對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

表1 0.1%升汞不同滅菌時間對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

以0．1%升汞作單一滅菌劑，分別進行不同滅菌時間的對此試驗，試驗結果見表1。

由表1可知，0．1%升汞對野生毛葡萄種子的滅菌時間不同，滅菌效果不同，發芽率也不同。不同處理之間對種子的滅菌效果和發芽率的差異達到極顯著水平。滅菌時間越長，種子的污染率越低。在0．1%升汞滅菌10－16min的時間范圍內，種子污染率逐步降低，而種子的發芽率逐漸提高。從5個滅菌時間處理中，雖然18min處理的污染率最低，但發芽率也開始降低；16min處理的污染率雖不是最低，但是發芽率比其他幾個處理都高，達到35%。綜合滅菌效果和發芽率比較，以0．1%升汞滅菌16min的時間處理最佳。但是用升汞作單一滅菌劑，污染率仍較高，發芽率也較低，無法滿足需要。

2．2 兩種滅菌劑不同組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

以0．1%升汞16min與75%酒精不同滅菌時間組合進行比較，試驗結果見表2。

表2 兩種滅菌劑不同組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

由表2可知，0．1%升汞16min和75%酒精不同滅菌時間組合，對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響不同。不同處理之間對種子的滅菌效果的差異達到極顯著差異水平，對發芽率的差異達到顯著水平。隨著75%酒精滅菌時間的增加，滅菌效果越好，種子的污染率越低。75%酒精滅菌時間從10－30s范圍中，發芽率逐漸提高，但是到了滅菌時間40s，種子的發芽率反而下降。所以，綜合比較試驗結果，以75%酒精＋0．1%升汞16min兩種滅菌劑組合表現最佳，野生毛葡萄種子的污染率為36%，發芽率為48．33%。

2．3 三種滅菌劑不同組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

以75%酒精30s＋0．1%升汞16min與不同濃度的升汞或者次氯酸鈉的組合進行比較試驗，試驗結果見表3：

表3 三種滅菌劑組合對野生毛葡萄種子滅菌效果和發芽率的影響

由表3可知，以75%酒精＋0．1%升汞16min與不同濃度的升汞或次氯酸鈉的組合不同，滅菌效果和發芽率也不同。不同處理之間對種子滅菌效果的差異達顯著水平，對發芽率的差異達極顯著水平。在75%酒精30s＋升汞16min前提下，在相同的5min滅菌時間處理時，0．12%升汞發芽率比0．15%升汞高，但是0．15%升汞的滅菌效果比0．12%升汞的滅菌效果好。在75%酒精30s＋0．1%升汞前提下，在相同的5min滅菌處理時，15%次氯酸鈉比12%次氯酸鈉的滅菌效果和發芽率都好，污染率為16．67%，發芽率為61．67%。綜合試驗比較結果，以75%酒精＋0．1%升汞16min＋15%次氯酸鈉5min的三種滅菌劑組合效果最佳，野生毛葡萄種子的污染率為 16．67%，發芽率為 61．67%。

2．4 野生毛葡萄種子不同預處理對污染率和發芽率的效應

以常溫（20℃）無菌水作為對照，進行40℃無菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）無菌溶液進行浸種試驗，比較不同處理對種子發芽率的影響，試驗結果見4。

由表4可知，對野生毛葡萄種子的預處理不同，種子的發芽率也不同。三個處理之間對野生毛葡萄種子發芽率的差異達到極顯著水平。40℃無菌水浸種2h的發芽率比常溫（20℃）無菌水浸種2h的發芽率高，達到66．67%；GA3 0．5mg/L（40℃）無菌溶液浸種2h的發芽率比40℃無菌水浸種2h發芽率高，達到73．33%。綜合比較試驗結果，以－4℃冰箱保存40d＋GA3 0．5mg/L（40℃）無菌溶液浸種2h為最佳野生毛葡萄種子的預處理方法。

表4 不同預處理對野生毛葡萄種子污染率和發芽率的效應

3 結果與討論

升汞、75%酒精、次氯酸鈉是組織培養中進行外植體消毒時常用的消毒劑。升汞中水解出來的Hg2＋離子可與帶負電荷的蛋白質結合，使細菌蛋白變性，酶失活，達到消毒目的。75%酒精有很強的滲透力，能穿過細菌表面的膜，進入細菌內部，使構成細菌生命基礎的蛋白質凝固，將細菌殺死。次氯酸鈉是強氧化劑，利用其強氧化性能殺死病菌。

試驗結果表明，在單一滅菌劑0．1%升汞的滅菌時間達到18min時，滅菌效果雖然最好，但是種子的發芽率卻降低。根據升汞的滅菌原理可知，在滅菌時間延長時，Hg2＋與細菌蛋白質結合會更加徹底，滅菌效果就會更好，但是Hg2＋與種胚中蛋白質的結合機率也會加大，從而導致種胚失去活性，發芽率降低。因此，單一滅菌劑0．1%升汞對野生毛葡萄種子的適宜滅菌時間為16min。

在兩種滅菌劑組合的75%酒精滅菌時間達到40s，雖然滅菌效果提升，但野生毛葡萄種子的發芽率卻從滅菌30s時的48．33%下降到41．67%。由此可知，隨著75%酒精滅菌時間越長，酒精對細菌細胞膜的穿透力和對種胚的穿透力就會增強，對細菌和種胚的破壞性就會增強。因此，在野生毛葡萄種子的滅菌處理中，0．1%升汞16min組合的75%酒精的適宜處理時間為30s。

野生毛葡萄種子的萌發首先要解除種子的休眠，根據甘陽英等人研究不同種源的葡萄種子休眠及其解除時發現，野生葡萄種子的休眠為生理休眠［8］。曾有研究證明，次氯酸鈉能在一定程度上解除種子的休眠［9］。本試驗結果表明，15%次氯酸鈉處理5min的野生毛葡萄種子發芽率要比0．15%升汞處理5min的好。

用40℃無菌水和GA3 0．5mg/L（40℃）無菌溶液浸泡進行預處理，對野生毛葡萄種子均能提高種子的發芽率，說明溫水和赤霉素在一定程度上可以促進野生毛葡萄種子的萌發。傅強等人研究時發現，熱水浸泡可以軟化種皮，減少種皮表層的蠟質和油層，增強種皮的通透性，并且能浸出發芽抑制物［10］。赤霉素能誘導產生水解酶，使種子中的貯藏物質從大分子水解為小分子，如蛋白質水解為氨基酸、淀粉水解為糖，為胚所利用，促進胚后成熟，至于赤霉素促進野生毛葡萄種子萌發的適宜濃度，還有待進一步研究。

［1］鄒瑜．野生毛葡萄種質資源及利用研究進展［J］．廣西農業科學，2008，39（5）：664－667．

［2］AlleweldtG，Speigel－Roy P，Reisch B．Grapes（Vitis）［J］．Genetic Resourcesof Temperate Fruitand NutCrops290，1991：291－330．

［3］孫馬，王躍進．中國野生葡萄染色體倍性研究［J］．西北農學學報，2006，15（6）：148－152．

［4］李玉鵬，黃燕，吳紹華．野葡萄營養成分的測定［J］．云南化工，2008，35（1）：50－51．

［5］繆冰旋．野生葡萄及葡萄酒抗氧化活性和抗菌性研究［D］．暨南大學，2014．

［6］張劍俠，王賀飛，徐炎，等．中國野生葡萄組織培養研究［J］．西北植物學報，2003，23（3）：460－463．

［7］劉偉．貴州葡萄屬野生種快速繁殖及離體再生研究［D］．貴州大學，2010．

［8］甘陽英，李紹華，宋松泉，等．不同種源的葡萄種子休眠及其解除的研究［J］．生物多樣性，2008，16（6）：570－577．

［9］比尤利．J．D，布萊克．M．種子萌發的生理生化，第二卷，生活力、休眠與環境控制［M］．南京：東南大學出版社，1989：48－152．

［10］傅強，楊期和，葉萬輝．種子休眠的解除方法［J］．廣西農業生物科學，2003，22（3）：230－234．