干酪用乳酸菌的特性研究及其在高達干酪模型中風味分析

黃宜，劉振民，莫蓓紅，郭本恒，吳正鈞

(1.光明乳業(yè)股份有限公司上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，上海 200436;2.上海海洋大學 食品學院，上海 201306)

干酪，又名奶酪，有各式各樣的味道、口感和形式。干酪以奶類為原料，含有豐富的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，因此具有很高營養(yǎng)價值［1］。隨著我國人民生活水平的提高，對像干酪這種高營養(yǎng)健康食品需求量越來越多［2］。據(jù)海關(guān)信息網(wǎng)統(tǒng)計，我國奶酪進口量從2004 年的7 244.1 t 增加到2013 年的47 330.9 t，年平均增長率為23.2%。

在干酪生產(chǎn)和成熟過程中，微生物菌群促進了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)和風味的形成。這些微生物主要包括發(fā)酵劑微生物和非發(fā)酵劑微生物［3］。發(fā)酵劑微生物包括中溫發(fā)酵劑中的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和明串珠菌屬(Leuconostoc.spp)等，嗜熱型發(fā)酵劑中的嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)，德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)和瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)等［4］。發(fā)酵劑微生物的作用是在干酪生產(chǎn)過程中能夠快速發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生高濃度的乳酸，提高凝乳酶的活性，有助于排除乳清和抑制有害菌生長。非發(fā)酵劑菌群主要是指乳酸菌(LAB)，在切達和荷蘭式干酪中最常見的是嗜溫乳酸菌，它們對干酪獨特風味和眼孔的形成以及增強微生物的生存能力具有重要作用［5-6］。除了添加的發(fā)酵劑外，還存在著一些來自生產(chǎn)和加工過程中混入的微生物，對干酪也有一定影響。干酪中微生物的特點是大量的細菌、酵母和霉菌的共存，且許多因素影響它們的生存與生長［7］。

本研究從中國傳統(tǒng)乳制品中分離到的嗜溫性乳酸菌進行篩選，將不同特性的乳酸乳球菌與產(chǎn)香型明串珠菌進行組合，以達到快速產(chǎn)酸型和產(chǎn)香型發(fā)酵劑結(jié)合的目的，應用于高達干酪模型中，了解干酪在成熟期的風味變化。為天然干酪的生產(chǎn)、品質(zhì)評定提供一定的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

供試菌株，乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室光明乳業(yè)菌種保藏中心提供;CHOOZIT RM 32 型直投式發(fā)酵劑;MARZYME150MG 型凝乳酶;M17agar、M17肉湯培養(yǎng)基、氯化鈉、蔗糖均為分析純;脫脂乳粉，食品級;無抗生素鮮牛奶。

GC 6890 N 氣相色譜議;5975 MSD 質(zhì)譜儀;100 μm的PDMS(2 cm)固相微萃取萃取頭;DELTA 320 型pH 計;UV 2300 型紫外分光光度計。

1.2 菌株活化

將實驗室保存的41 株乳酸乳球菌和47 株明串珠菌從凍存管中取出，以2%(v/v)的接種量接種于經(jīng)過121 ℃、15 min 滅菌的M17 肉湯培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)36 h，連續(xù)活化三代。

1.3 菌株的初步篩選

1.3.1 模擬干酪成熟環(huán)境初篩 將活化好的菌株接種在含有NaCl 濃度4%，pH 值為5.0 的液體M17培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長情況。

1.3.2 菌株不同溫度環(huán)境生長測試 將活化好的菌株接種在M17 平板中，分別置于15，30，40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)36 ～72 h，觀察平板上面菌落的生長情況［8］。

1.3.3 菌種鑒定 將初篩符合條件的細菌進行培養(yǎng)，提取細菌基因組的DNA，對16 S rDNA 進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，對擴增產(chǎn)物進行序列測定與分析。

1.3.4 對產(chǎn)香型明串珠菌的篩選 將活化好的明串珠菌按2%的量接種于裝有100 mL 脫脂乳培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16 h，進行產(chǎn)香評定。評估小組由6 名專業(yè)感官評價人員組成，對每個菌株的發(fā)酵脫脂乳香味進行評估，根據(jù)各自判斷對不同菌株發(fā)酵脫脂乳的香味濃度進行打分，以“+”表示濃度的強度，最高為“+ + + + +”。

1.4 菌株的特性測試

1.4.1 菌株的產(chǎn)酸性能 將各菌株按1%(v/v)的量接種于裝有脫脂乳液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 h 取出一支三角瓶，以未接種的脫脂乳液體培養(yǎng)基作為對照，測pH 值。以時間為橫坐標，繪制各菌株在脫脂乳中pH 值的變化曲線。

1.4.2 菌株在脫脂乳中的凝乳時間和黏度測定將各供試菌株分別以1%(v/v)的量接種于滅菌脫脂乳培養(yǎng)基中，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，直至凝乳，并于4 ℃環(huán)境下保存24 h，用旋轉(zhuǎn)黏度計分別測定各發(fā)酵酸乳的黏度(mPa·s)，測定時選擇2 號轉(zhuǎn)子，速度設置為64 r/s，每隔15 s 取值1 次，測定3 min。

1.4.3 發(fā)酵牛乳特性測試 將各供試菌株分別以1%(v/v)的量接種于滅菌脫脂乳中，置于30 ℃條件下培養(yǎng)，待凝乳后考察其風味、乳清析出狀況及凝塊質(zhì)地。

1.4.4 菌株蛋白酶活力測試 福林(Folin)-酚試劑法測定蛋白酶活力:取1 mL pH 7.0、濃度為2%酪蛋白底物緩沖液，加入1 mL 酶液后迅速混勻，并立即放入40 ℃恒溫水浴中，準確計時，10 min 后立即加入0.4 mol/L TCA 溶液2 mL，終止反應。離心除去酪蛋白沉淀物。取濾液1 mL，加入2. 5 mL 0.28 mol/L NaOH 溶液，混勻，于25 ℃左右放置10 min。加入0.75 mL 福林酚試劑，立即搖勻，于35 ℃左右反應15 min，在660 nm 下測定其吸光值［9］。

1.5 實驗組分組

以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，對篩選出的乳酸乳球菌菌株進行分組，并分別與明串珠菌進行結(jié)合，進而得到不同組合的菌株，組合出不同蛋白水解能力的菌株。

1.6 菌株的共生性能測試

將選出的菌株以1%(v/v)接種量分別接種到121 ℃滅菌15 min 的M17 培養(yǎng)基中，再將各菌株以1∶1∶1∶1 的比例，按1%總的添加量接種到M17 肉湯培養(yǎng)基中，置于30 ℃培養(yǎng)，每2 h 測1 次其在600 nm下的吸光度。以時間為橫坐標，OD 值為縱坐標繪制生長。

將各菌株以1∶1∶1∶1 的比例，按1%總的添加量接種到脫脂乳培養(yǎng)基中，記錄組合菌株的凝乳時間及其pH 值［10］。

1.7 高達干酪模型的制作工藝流程

制作8 個高達干酪樣品:其中1 個為對照樣品，對照樣品使用高達干酪專用發(fā)酵劑CHOOZIT RM 32，另外7 個為實驗樣品，實驗樣品中添加的乳酸菌按照2.7 的分組結(jié)果進行，每一個干酪模型樣品用無抗菌素鮮牛乳(1 000 g)來制作。

鮮牛乳(1 000 g )→過濾殺菌(72 ～75 ℃，15 ～18 min)→冷卻(31 ～33 ℃)→添加氯化鈣(0.1 g/L)→加入發(fā)酵劑→產(chǎn)酸→添加凝乳酶(20 mL/100 L)→凝乳→切割凝塊→熱燙(39 ～40 ℃)→排乳清→凝塊破碎和鹽漬(浸漬在濃度為20% 的鹽水中)→成型→包裝15 ℃后熟(在食品級塑料袋內(nèi)真空包裝)。

1.8 高達干酪模型的揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

1.8.1 色譜分析條件 程序升溫條件設置:進樣后以60 ℃作為初始溫度保持5 min，以5 ℃/min 升溫至120 ℃，保持5 min，以8 ℃/min 升溫至240 ℃，保持10 min，運行總時間為47 min;色譜柱型號選用DB-5，進樣口設置為250 ℃，離子源選擇EI，四級桿設置為150 ℃，傳輸線設置為280 ℃，載氣為He，選擇不分流進樣模式，載氣流速1 mL/min，電離方式EI(70 eV)，質(zhì)量掃描范圍30 ～350 m/z。

1.8.2 固相微萃取SPME 條件［11］使用100 μm的PDMS 固相微萃取頭吸附時間為5 min。

1.8. 3 樣品處理 取樣品5 g，恒溫水浴時間60 ℃，吸附時間為30 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選及鑒定結(jié)果

菌株的篩選及鑒定結(jié)果見表1。

表1 菌株的篩選及鑒定結(jié)果Table 1 The result of screening and identification of the strains

2.2 明串珠菌的產(chǎn)香篩選

3 株明串珠菌的產(chǎn)香評定結(jié)果見表2。

由表2 可知，腸膜明串珠菌H 香味最佳。因此，選擇此菌株H 與乳酸乳球菌進行組合。

表2 明串珠菌的產(chǎn)香篩選結(jié)果Table 2 The result of aroma producing screening of Leuconostoc

2.3 菌株的產(chǎn)酸速率

優(yōu)良干酪發(fā)酵劑菌株的選擇，產(chǎn)酸速度是關(guān)鍵。在干酪的加工過程中，發(fā)酵劑菌株一個重要的作用是分解乳糖產(chǎn)生乳酸，降低牛乳的pH 值，促進凝乳酶凝乳，并且在干酪的成熟過程中，低pH 環(huán)境能夠有效抑制致病菌和腐敗微生物的生長。

圖1 菌株產(chǎn)酸速率Fig.1 Acid producing activity of different strains

由圖1 可知，菌株A、B 產(chǎn)酸速度較快。24 h 后pH 最低。菌株的產(chǎn)酸速度影響干酪生產(chǎn)過程中牛乳的預酸化時間，產(chǎn)酸能力強，可以加快牛乳預酸化的速度，酸的形成有利于發(fā)揮凝乳酶的作用和增加乳中鈣的溶解，以便于凝塊形成。

2.4 菌株在脫脂乳中的凝乳時間和產(chǎn)黏性能測定結(jié)果

凝乳時間長，對凝乳質(zhì)地和風味形成有一定的作用，但會使生產(chǎn)時間延長。產(chǎn)酸快的菌株可以縮短凝乳時間，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，但是考慮到實際生產(chǎn)中，如果菌株產(chǎn)酸太快或者凝乳不好，將不利于干酪的生產(chǎn)［12］。

表3 乳酸乳球菌在脫脂乳中的凝乳時間和凝乳黏度Table 3 The curding rate of different Lactococcus lactis strains and viscosity of the curd formed in skim milk

由表3 可知，菌株A、B、C 凝乳相對較快，菌株A、B、D 黏度相對較高。選擇產(chǎn)黏能力適中的菌株是制備優(yōu)質(zhì)干酪的另一關(guān)鍵因素。

2.5 菌株的發(fā)酵性能

表4 為不同乳酸乳球菌的發(fā)酵牛乳性能。

表4 菌株的發(fā)酵性能Table 4 The fermentation performance of the strains

2.6 蛋白水解能力

由圖2 可知，發(fā)酵質(zhì)量濃度100 g/L 的脫脂乳，菌株蛋白水解能力A 和B 比較強。在干酪成熟過程中，發(fā)酵劑菌株將蛋白質(zhì)分解為多肽、胨、氨基酸以及其它無機和有機小分子物質(zhì)，對干酪風味的形成有著重要作用。

圖2 乳酸乳球菌的蛋白水解能力測試結(jié)果Fig.2 The results of proteolytic ability of different strains

2.7 組合菌株生長相互作用研究

以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，進行分組后，與明串珠菌進行結(jié)合，組合出了不同蛋白水解能力的菌株，見表5。以高達干酪專用發(fā)酵劑CHOOZIT RM 32 制作的干酪作為對照。

表5 對菌株的分組Table 5 The grouping result of strains

2.7.1 菌株單獨培養(yǎng)時的生長曲線和共同培養(yǎng)時的生長曲線 見圖3、圖4。

圖3 各菌株的生長曲線Fig.3 The growth curve of different strains

由圖3 可知，菌株A、B、C、D 在6 h 進入對數(shù)生長期，16 h 時進入穩(wěn)定期，菌株E 和H 在4 h 進入對數(shù)生長期，15 h 進入穩(wěn)定期，之后生長逐漸趨于平緩。

由圖4 可知，各菌株組合在培養(yǎng)前期生長速度均較緩慢，在培養(yǎng)16 h 后OD 值達到最高。因此，選取16 h 為各發(fā)酵實驗的發(fā)酵終點。共同培養(yǎng)時菌株生長量顯著高于相同條件下A、B、C 的生長量，略低于E、H 的生長量。

圖4 不同乳酸菌組合的生長曲線Fig.4 The growth curve of different experimental groups

2.7.2 組合菌株產(chǎn)酸性能 見表6。

表6 組合菌株產(chǎn)酸性能測定結(jié)果Table 6 Acid producing result of different experimental groups

由表6 可知，菌株組合發(fā)酵脫脂乳約7 h 時使pH 值降低到4.3，而菌株單獨培養(yǎng)時只有菌株A、B經(jīng)過18 h 培養(yǎng)才能達到4.3 左右。因此，當菌株共同生長時，產(chǎn)酸能力明顯強于菌株單獨培養(yǎng)時。

2.8 干酪中的揮發(fā)性風味物質(zhì)

干酪成熟6 周后產(chǎn)生的主要風味物質(zhì)及相對含量見表7。菌株組合2 和組合3 制作的高達干酪可檢出的風味物質(zhì)明顯多于對照組和其它實驗組［13］，檢測到的胺類化合物含量比較低。酮、酸和酯類化合物是干酪風味的主要來源，其中對干酪的特征風味組分貢獻最大的化合物有7 種(即已烷、2-戊酮、丁酸乙酯、2-丁醇、庚酮、草酰乙酸、丁酸)，酮類物質(zhì)的風味閾值相對較低，且在干酪樣品中的含量相對較高，因此對干酪的風味貢獻較大。其中，3-羥基-2-丁酮表現(xiàn)為奶香味和脂肪味［14］。

表7 SPME-GC-MS 對不同組別的干酪模型中主要揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定結(jié)果Table 7 The result of main flavor compositions of different experimental groups cheese model by SPME-GC-MS

3 結(jié)論

(1)以菌株的產(chǎn)酸能力為主，產(chǎn)黏能力為輔，組合出7 組產(chǎn)酸能力強，同時蛋白水解能力不同差異的菌株組合，再與產(chǎn)香型的腸膜明串珠菌LM 79 進行，發(fā)現(xiàn)將乳酸乳球菌BD 3170、BD 2263、BD 164、BD 401、BD 732 和腸膜明串珠菌LM 79 共同培養(yǎng)時，各組合中菌株之間具有良好的互生作用。

(2)通過SPME-GC-MS 對各不同乳酸菌組合制作的高達干酪模型進行揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定，與商業(yè)發(fā)酵劑制作的對照組干酪相比，發(fā)現(xiàn)組合2 和組合3 制作的高達干酪可檢出的風味物質(zhì)中組分平衡結(jié)果最好，其中3-羥基-2-丁酮、2-戊酮、庚酮等風味表現(xiàn)良好的風味物質(zhì)含量較高，風味表現(xiàn)不好的物質(zhì)如胺類的含量比較低。因此，乳酸菌組合2(BD 3170、BD 2263、BD 164、LM 79 按照1∶1∶1∶1的比例添加)和組合3(BD 2263、BD 164、BD 401、LM 79 按照1∶1∶1∶1 的比例添加)具備開發(fā)成高達干酪的發(fā)酵劑的潛力。

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