高效液相色譜法測定東洞庭湖區野生水芹莖葉中氨基酸

易雪靜，周石柔，鄧蘭青，徐中海

(1.岳陽職業技術學院 醫學基礎部，湖南 岳陽 414000;2.岳陽市洞庭湖區特色中藥材綜合利用重點實驗室，湖南 岳陽 414000)

水芹(Oenanthe javanica )系傘形科多年生草本植物，一般生于低濕洼地、淺水沼澤、河流岸邊。全國大部分省份均有分布，洞庭湖區野生水芹資源尤為豐富。水芹很少或不受病蟲危害，無需施用農藥、化肥，其莖、葉均可食用，品質鮮嫩爽口，風味獨特，食療俱佳，是很有前途的藥用植物和保健蔬菜。水芹全草入藥，氣味甘、平，有清熱解毒、利尿、止血和降壓功效。主治感冒發燒、暴熱煩渴、嘔吐腹瀉、黃疸、水腫、尿路感染、淋病、白帶、崩漏、瘰疬和腮腺炎等癥［1］。近年來研究發現水芹具有抗氧化、抗乙肝病毒、降壓降脂、抗過敏、抗凝血等多種功效［2-3］。水芹化學成分僅有揮發油［4-5］、黃酮［6］、維生素E［7］的研究報道，未見其氨基酸成分的研究文獻。

氨基酸是組成蛋白質的基本單元，是人體必需的營養成分，具有非常重要的生理功能。隨著在食品、化學和臨床醫學等領域的研究逐漸深入，氨基酸分析顯得越來越重要。目前對氨基酸分析常采用的檢測方法有離子交換色譜、氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法等，檢測方法也包括紫外可見光譜吸收法、熒光法、化學發光法等。與其它分析方法相比，HPLC 柱前衍生熒光分析法具有分析操作簡單、分離度好和重現性好等優點，近年來已廣泛應用于氨基酸的分析測定。且鄰苯二甲醛本身不發熒光，色譜分離中不會形成干擾峰，檢測靈敏度高。

本文采用鄰苯二甲醛作為柱前衍生化試劑，結合反相高效液相色譜技術，對東洞庭湖區野生水芹莖、葉中15 種常見氨基酸進行了定性和定量分析，取得了較好的效果。為進一步研究水芹的藥用價值，探討水芹中氨基酸與其它成分的相互作用提供了一定的依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

水芹采自東洞庭湖區芭蕉湖畔，60 ℃烘干后備用;氨基酸(SIGMA)、甲醇(液相色譜用)、無水乙醇、四氫呋喃、醋酸、無水醋酸鈉、硼酸、鄰苯二甲醛(SIGMA)均為分析純;所用水均為二次重蒸餾水。

Shimadzu LC-6A :SCL-6A SYSTEM CONTROL;Shimadzu LC-6A pump;Detector RF-530 Fllourence HPLC;TGL-1 離心機。

1.2 溶液配制

1.2.1 標準溶液 準確稱取天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、蛋氨酸(Met)、纈氨酸(Val)、苯丙氨酸(Phe)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、賴氨酸(Lys)各適量，用0.1 mol/L HCl 配制成0.5 mmol/L溶液，置于4 ℃避光保存。乙酸鈉溶液配制:4.04 g無水乙酸鈉，溶于1 000 mL 水中，0. 25 μm 濾膜過濾。

1.2. 2 衍生化試劑 10 mg 鄰苯二甲醛，加入0.6 mL醇，2.4 mL 2%硼酸，30 μL 巰基乙醇。

1.2.3 流動相 A 液:100 mL 甲醇加入900 mL 乙酸鈉溶液以及10 mL 四氫呋喃，超聲脫氣。B 液:800 mL 甲醇加入200 mL 乙酸鈉溶液以及10 mL 四氫呋喃，超聲脫氣。

1.3 實驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱:依利特Hypersil ODS(25 μm，4.6 mm ×150 mm)，柱溫35 ℃，流動相0 ～4 min:A 液100%，4 ～5 min:A 液100% ～79%，B 液0 ～21%，5 ～20 min:A 液79% ～77%，B液21% ～23%;20 ～21 min:A 液77% ～0，B 液23% ～100%;26 ～27 min:A 液0 ～100%，B 液100% ～0。流速1 mL/min，檢測波長熒光檢測器EM:430 nm，EX:338 nm。

1.3.2 樣品處理 精密稱取水芹莖、葉各1 g 左右，分別置于20 mL 安培瓶中，分別加入6 mol/L HCl 10 mL，封口后于110 ℃水解12 h，冷卻后過濾，分別取0.2 mL 于60 ℃水浴吹干，加入A 液1.0 mL溶解并轉入1.5 mL 離心管中，于12 000 r/min 離心3 min，4 ℃避光保存，備測。

1.3.3 樣品的測定 取5 μL 樣品于1.5 mL 離心管中，加入50 μL 衍生試劑，渦旋振蕩1 min。取20 μL注入色譜儀。以峰面積工作曲線定量，以保留時間定性。

2 結果與討論

2.1 樣品中氨基酸分析與含量測定

水芹葉樣品中氨基酸分析的高效液相色譜圖見圖1。

圖1 水芹葉氨基酸高效液相色譜圖Fig.1 High-performance liquid chromatogram of amino acids in leaves of oenanthe javanica

由圖1 可知，水芹莖樣品的色譜圖與水芹葉樣品類似，只是氨基酸的含量有所差異。水芹莖和葉中各種氨基酸的含量測定結果見表1。

表1 水芹莖葉中氨基酸的種類和含量Table 1 The content of amino acids in stems of oenanthe javanica

由表1 可知，水芹葉及莖中氨基酸含量豐富，總量分別達到6.939 g/100 g 和1.882 g/100 g。其中以天冬氨酸、谷氨酸含量最高，在葉中占氨基酸總量的14%和15%，在莖中占到35%和19.9%，蛋氨酸含量最低。葉及莖中必需氨基酸含量分別為2.858 g/100 g和0.483 g/100 g，必需氨基酸占氨基酸總量的41.19%和25.67%。

2.2 討論

本研究采用常用的柱前衍生法、熒光檢測器，能測定出水芹莖、葉中15 種常見氨基酸成分的含量，且柱效和分離度均很滿意，其精密度和準確度可以滿足定性和定量的要求。

野生水芹中氨基酸的含量分析，目前國內未見報道。本文利用反相高效液相色譜法對東洞庭湖區野生水芹莖葉中的氨基酸進行了分析研究。結果表明，水芹莖及葉中氨基酸含量豐富，且葉中含量要高于莖中含量，也提示人們在食用水芹時更要注意葉的食用。水芹葉中必需氨基酸在總氨基酸中占到41. 19%，達到了WHO/FAO 提出的理想蛋白質EAA/TAA 為40%的要求［8］，是開發食品的理想原料。根據文獻比較［9-10］，水芹葉中氨基酸總量及必需氨基酸所占比例均高于經常食用的香菇、結球甘藍、仙人掌、生菜、黃瓜等常見蔬菜。其中含量最高的天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的氨基酸，是決定水芹口味口感的內在因素。且天冬氨酸在中樞神經系統和脊索某些部位有興奮神經遞質作用，臨床廣泛用于治療肝炎、肝硬化、肝昏迷［11］;谷氨酸具有紅細胞生成、改善腦細胞營養及活躍思想的作用，是治療神經衰弱和記憶力減退的有效成分［12］。因此，水芹中高含量的天冬氨酸和谷氨酸可能是其具有保健功能的重要物質基礎。

3 結論

本研究對水芹莖及葉中氨基酸的組成及含量進行了分析，共分離測定了15 種氨基酸。水芹莖及葉中氨基酸含量豐富，必需氨基酸在總氨基酸中占很大比例。氨基酸在人體的需要量雖然不大，但卻有極其重要的生理功能，因此水芹可用于食品、醫藥等領域，具有很好的應用和開發前景。

研究中采用高效液相色譜-柱前衍生熒光分析法測定氨基酸的含量，分離方法簡便，易于操作，結果可靠。該分析方法可為其他植物中氨基酸成分的分析提供參考。

［1］ 江蘇新醫學院.中藥大辭典［M］.上海:上海科技出版社，1986:512.

［2］ Zheng S K，Yang Z F，Sun M.Pollutant removal from municipal sewage in winter via a modified free-water-surface system planted with edible vegetable［J］. Desalination，2010，250:158-161.

［3］ Wang W N，Yang X B，Liu H Zh，et al. Effect oenanthe javanica flavone on human and duck hepatitis B virus infection［J］. Acta Pharmacologica Sinica，2005，26(5):587-592.

［4］ 徐中海，劉克清，周石柔，等.氣相色譜-質譜法測定水芹中揮發油化學成分［J］. 理化檢驗-化學分冊，2010，46(1):89-92.

［5］ Won Ho Seo，Hyung Hee Baek.Identification of characteristic aroma-active compounds from water dropwort (oenanthe javanica DC.)［J］.J Agic Food Chem，2005，53:6766-6770.

［6］ Ma J C，Lee K Y，Jeong E J，et al. Persicarin from water dropwort (oenanthe javanica)protects primary cultured rat cortical cell from glutamate-induced neurotoxicity［J］.Phytother Res，2009，10:3065-3070.

［7］ Ling Soon Ching，Suhaila Mohamed.Alpha-tocopherol content in 62 edible tropical plants［J］. J Agic Food Chem，2001，49:3101-3105.

［8］ Pellett P L，Young V R. Nutritional evaluation of protein foods［M］. Tokyo:The United National University，1980:26-29.

［9］ 薛穎，宋曙輝，武興德，等. 食用仙人掌的營養成分分析［J］.天然產物研究與開發，2000，12(5):8-12.

［10］ 陸寧，檀華蓉，楊勇勝. 香菇中蛋白氨基酸成分分析［J］.食品研究與開發，2002，23(6):94-95.

［11］郁瓊花，刑增濤，王少鷗，等.紅花菜(浙江產)營養成分分析［J］.上海農業學報，2002，18(1):55-57.

［12］吳啟南，王立新，吳德康.合子草中氨基酸及無機元素成分分析［J］.時珍國藥研究，1996，7(4):204-205.