金銀花綠原酸的酶解工藝及抗氧化活性研究

石奇

(西安文理學院 化學工程學院，陜西 西安 710065)

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花［1］。古人將其列為上品，素有“久服輕身”的說法，現代研究表明其具有抗氧化［2］、抗腫瘤［3］、抑菌［4］等功效。綠原酸是植物細胞在有氧呼吸過程中經磷酸戊糖途徑的中間產物合成的一種苯丙素類物質［5］，綠原酸作為金銀花的主要活性成分之一［6-7］，曾引起學者的廣泛關注［8-9］。但目前提取過程主要存在提取時間過長，提取溫度較高，金銀花綠原酸活性降低等問題。酶解法提取植物中有效成分具有快速、高效、反應時間短、條件溫和等諸多優點［10-11］。

羥基自由基(OH·)是一種能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物的活性氧［12］。衰老的自由基學說認為，超氧陰離子自由基(O2－·)是生物代謝過程中產生的高毒活性氧［13］。油脂過氧化值(POV)是油脂及其制品酸敗程度的標志，POV值越大，說明酸敗程度越高［14］。

本研究采用纖維素酶對金銀花綠原酸提取工藝進行優化，以維C 為對照，評價其對OH·、O2－·以及油脂的抗氧化活性，以期為金銀花綠原酸在食品和醫藥方面的應用研究提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

金銀花(產自河北省邢臺市);纖維素酶(酶活力≥400 U/mg);綠原酸標準品(純度≥98%);豬油;無水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、硫代硫酸鈉、三氯甲烷、碘化鉀、鄰苯三酚、乙酸乙酯、雙氧水、無水碳酸鈉、冰乙酸均為分析純;乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純。

RE-52AA 型旋轉蒸發儀;LXJ-64-01 型離心機;TV-180 紫外-可見分光光度計;FZ102 型粉碎機;DF-101S 恒溫水浴鍋;AGILENTLC 12 型高效液相色譜儀。

1.2 金銀花綠原酸提取工藝

取100.00 g 金銀花干燥粉末，加入纖維素酶，在乙醇水溶液中定溫提取，離心分離，得金銀花濾渣。再次提取，合并2 次提取液，減壓濃縮，在冰浴中對液體進行滅酶活處理，用乙酸乙酯純化處理［15］，低溫真空干燥，得金銀花綠原酸。

1.3 金銀花綠原酸含量測定

采用高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸［16］。色譜柱為C18 粒(250 nm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈∶0.4%磷酸(15∶85)，超聲處理15 min，流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進樣量20 μL，樣品在進樣前經0.45 μm 濾膜過濾。

精密稱取綠原酸對照品0.010 6 g，加50%甲醇溶解，并稀釋至50.0 mL，即為對照品溶液。分別吸取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL 置棕色量瓶中，加50% 甲醇稀釋至10.0 mL，搖勻，按上述色譜條件，以峰面積積分值為縱坐標，濃度為橫坐標，得綠原酸標準工作曲線y =5.322 1x +0.581 9，相關系數為R2=0.999 6。

1.4 抗氧化活性測定

1.4.1 羥基自由基OH·的清除能力測定 OH·體系的產生［17］，根據實驗過程略作修改。吸取0.75 mmol/L的鄰二氮菲無水乙醇溶液1.0 mL，依次加入pH=7.4 磷酸鹽緩沖液2 mL，0.75 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，蒸餾水2.0 mL，反應液35 ℃水浴保溫1.5 h，參比溶液用蒸餾水代替FeSO4溶液，于536 nm 處測定吸光度A0。在上述條件下，蒸餾水減少1 mL，相應加入1 mL 0.01% H2O2溶液，測定吸光度A1。

對OH·的清除能力進行測定:按上述步驟，在加H2O2前，以配制好的不同濃度的綠原酸溶液或維C 溶液代替1.0 mL 蒸餾水，測定其吸光度Ax。

1.4.2 超氧陰離子自由基O2－·清除能力測定采用鄰苯三酚自氧化法［17］，根據實驗過程略作修改。分別吸取 50 mmol/L Tris-HCl 緩沖溶液2.5 mL，蒸餾 水3. 2 mL，在25 ℃水 浴 中保 溫20 min，取出加入25 ℃預熱過的3 mmol/L 鄰苯三酚0.3 mL，迅速搖勻后，在325 nm 下每隔5 min 測吸光度。參比溶液以0.01 mol/ L HCl 替代鄰苯三酚，計算吸光度隨時間的變化率C0。

對O2－·的清除能力進行測定:依上所述，在加入鄰苯三酚前，加入配制好的不同濃度的綠原酸溶液或維C 溶液1.0 mL，蒸餾水相應的減少1.0 mL，在波長為325 nm 下間隔5 min 測其吸光度。計算吸光度隨時間的變化率Cx。

1.4.3 綠原酸對豬油的抗氧化能力測定

1.4.3.1 供試樣品的制備 稱取金銀花綠原酸24 mg，溶于1 mL 乙醇中，加入20 g 豬油中，充分攪拌溶解，配成含氧化劑1.2 mg/g 的母液。根據實驗再配制出不同濃度的待測液。

1.4.3.2 油脂過氧化值測定過程［18］稱取2.00 ～3.00 g 混勻的試樣，加30 mL 三氯甲烷-冰乙酸混合液。加入飽和碘化鉀溶液1.00 mL，振搖后避光放置3 min。加100 mL 水，搖勻，用0. 01 mol/L NaS2O3標準滴定溶液滴定至藍色消失為終點，消耗NaS2O3溶液體積為V1，空白實驗消耗NaS2O3溶液體積為V0。

式中，c 為NaS2O3溶液的物質的量濃度;m 為用于測定所取油樣質量。

2 結果與討論

2.1 酶解提取工藝優化

根據前期單因素實驗結果，對提取溫度、酶用量、提取時間、乙醇體積分數4 個因素進行正交優化，以金銀花綠原酸提取率為考察指標，因素與水平見表1，結果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

由表2 可知，4 個因素對提取效果的影響程度大小為酶用量﹥提取時間﹥提取溫度﹥乙醇體積分數，確定最佳的工藝條件為:A2B2C1D2，即酶用量0.6%，提取時間60 min，提取溫度55 ℃，乙醇體積分數70%。在該最佳工藝條件下，重復3 次平行實驗，得金銀花綠原酸平均提取率為4.85%。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

2.2 HPLC 色譜檢測分析

將金銀花綠原酸樣品研成細粉，稱取細粉約0.5 g，加入50% 甲醇50 mL，超聲處理15 min，過濾。吸取濾液5 mL，加50% 甲醇至25 mL，即為提取樣品溶液。綠原酸對照品與提取樣品溶液各20 μL分別進樣測定，結果見圖1 和圖2。

圖1 綠原酸對照品HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard chlorogenic acid

圖2 金銀花綠原酸HPLC 圖Fig.2 HPLC chromatogram of chlorogenic acid from Lonicera Japonica

綠原對照品在圖1 中的出峰時間為3.13 min，圖2 中在3.13 min 也出現綠原酸最大吸收峰出峰，由此可以推斷，提取產品主要成分為綠原酸。

2.3 羥基自由基OH·的清除能力

金銀花綠原酸與維C 對OH·清除的結果見圖3。

圖3 金銀花綠原酸與維C 對OH·的清除率Fig.3 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the OH· scavenging rate

由圖3 可知，在0.2 ～0.5 mg/mL 質量濃度范圍內，金銀花綠原酸顯示出一定的抗氧化性，且隨著質量濃度的升高，它對OH·的清除能力增強，其最大清除率為61.26%。而同樣質量濃度下，維C 的最大清除率為56.23%。

為了更好的說明測試樣品的抗氧化性，對圖3中清除率曲線進行統計回歸，OH·清除率與不同待測物濃度的對數呈線性關系，回歸方程分別為y =18.20 lnx +74.62(金銀花綠原酸)，R2=0.994 0;y=12.65 lnx+ 65.80(維C)，R2=0.996 0。

以OH·被消耗掉50%所需抗氧化劑的用量(半抑制量IC50)來表征，在清除OH·體系中，金銀花綠 原 酸IC50為0. 258 6 mg/mL，維C IC50為0.286 8 mg/mL。IC50越小，清除自由基的能力越強，因此，對OH·清除效果金銀花綠原酸比維C略好。

2.4 超氧陰離子自由基O2－·的清除能力

金銀花綠原酸與維C 對O2－·清除的結果見圖4。

圖4 金銀花綠原酸與維C 對2·的清除率Fig.4 Effects of chlorogenic acid from Flos Lonicerae and VC on the O2－· scavenging rate

由圖4 可知，在0.1 ～0.4 mg/mL 質量濃度范圍內，顯示出金銀花綠原酸具有很強的清除O2－·的能力，且隨著質量濃度的升高，清除效果更好，其最大清除率為94.81%，而同樣質量濃度下，維C 的最大清除率為74.25%。

對圖4 中清除率曲線進行統計回歸，回歸方程分別為y=40.23 lnx+132.5(金銀花綠原酸)，R2=0.994 0;y=115.6 x+29.67(維C)，R2=0.989 0。

在清除O2－·體系中，金銀花綠原酸IC50為0.128 6 mg/mL，維C IC50為0.175 9 mg/mL，因此金銀花綠原酸對O2－·清除效果較好。

2.5 豬油抗氧化能力

將配好的7 份試樣放入恒溫箱65 ℃，每隔2 d，取樣測定豬油的過氧化值，觀測期為18 d。金銀花綠原酸及VC 對豬油的抗氧化能力見圖5。

圖5 油脂過氧化值隨時間變化Fig.5 The changes of POV value

由圖5 可知，在豬油中添加不同濃度提取物金銀花綠原酸和維C 后，所有測試組的POV 值都明顯低于空白油脂的值，說明提取物金銀花綠原酸和維C 對豬油都具有較好的抗氧化能力。當金銀花綠原酸添加量為360 mg/kg 時，抗油脂氧化能力最好;維C 在添加量為360 mg/kg 時，在實驗系列濃度內，也有相同的趨勢表現。因此可以推斷，測試樣品的抗氧化能力是隨其添加量的增加而增強的。金銀花綠原酸有更出色的表現，將POV 值在觀測期內維持在5.5 mol/g 以下。

3 結論

(1)通過正交實驗優化了纖維素酶解法提取金銀花綠原酸的工藝條件，最佳酶解工藝條件為:提取溫度55 ℃，酶用量(對底物濃度)0.6%，提取時間60 min，乙醇體積分數70%。此條件下，金銀花綠原酸平均提取率為4.85%。該研究工藝具有提取條件溫和、操作時間短，能夠極大的保證提取產品活性的特點。

(2)在體外抗氧化活性的研究中，金銀花綠原酸抗氧化能力與綠原酸濃度在一定范圍內成劑量關系。金銀花綠原酸添加量0.5 mg/mL 時，對OH·的清除率達61.26%，IC50為0.258 6 mg/mL，比維C效果略好。添加量0.4 mg/mL 時，對O2－·的清除率高達94.81%，IC50為0.128 6 mg/mL，清除效果明顯優于維C。金銀花綠原酸在恒溫65 ℃下，將POV值在18 d 內維持在5.5 mol/g 以下，金銀花綠原酸具較強的清除自由基及抗脂質過氧化能力。

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