樺褐孔菌總三萜提取工藝的研究

戚月婷，玄光善

(青島科技大學 藥學系，山東 青島 266042)

樺褐孔菌(Inonotus obliquus)又名樺樹菇、西伯利亞靈芝，中文學名為白樺茸。在外文資料中，其學名常以Inonotus obliquus(Fr. )Pilat 出現［1］。樺褐孔菌是一種極其珍貴的藥用真菌，屬多孔菌科褐臥孔菌屬，是一種生長在寒帶的木腐菌。樺褐孔菌菌核呈現瘤狀、無柄，外表黑色或黑褐色，內部黃褐色，老后表面深裂，很硬，干時脆。野生樺褐孔菌生于白樺、銀樺等樹的活立木的樹皮下或砍伐后樹木的枯干上。樺褐孔菌主要分布在北緯45 ～50°的中國的黑龍江和吉林、波蘭、芬蘭、北美北部、俄羅斯、日本北海道等地。樺褐孔菌是俄羅斯及東歐地區一帶的民間藥用真菌，其有效成分已經引起美國、韓國、日本等國科學家的高度重視。俄羅斯認為，樺褐孔菌是上帝賜給苦難人類的禮物。日本的研究人員高度評價樺褐孔菌為“萬能藥”。美國則把樺褐孔菌列入“特殊的天然物質”，作為未來宇航員們的飲品。

隨著對樺褐孔菌化學成分的研究日漸深入，大量活性成分被分離出來，包括多糖、三萜類化合物、樺褐孔菌素、樺褐孔菌醇、栓菌酸、木質素類和黑色素類等200 多種化學成分。研究發現，樺褐孔菌具有抗癌、防治糖尿病、抗衰老、增強機體免疫、防治艾滋病等多種藥理作用［2］。三萜類化合物作為樺褐孔菌的一種主要活性成分，可用于惡性腫瘤、糖尿病、肝病、心血管疾病以及艾滋病的預防和治療［3］。研究發現，其主要有效成分為羊毛脂烷型四環三萜［4］。

三萜類化合物的結構比較復雜，而且性質不太穩定，溫度太高會破壞其結構;難溶于水，易溶于有機溶劑。根據相似相容的原理，可選用極性相近的異丙醇作為提取溶劑［5］。超聲波輔助提取法，作為一種新技術，是利用超聲波產生的高速、強烈的空化效應和攪拌作用，破壞藥材細胞，促進溶劑滲透到藥材細胞中，大大縮短了提取時間。此技術效率高、節省溶劑，尤其對植物細胞壁內活性物質的提取具有優勢［6］。本實驗采用超聲輔助-回流提取法提取樺褐孔菌總三萜，以獲得最佳提取工藝參數，為后續的純化分離及工業化生產奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

樺褐孔菌，購于吉林長白山，干燥、粉碎、過40目篩后保存;齊墩果酸對照品(Sigma 公司，純度＞98%);香草醛、冰醋酸、高氯酸、異丙醇等均為分析純。

FW100 型高速萬能粉碎機;HB-6 型磁力攪拌恒溫水浴鍋;RE-5 型旋轉蒸發儀;KH-250DB 型數控超聲波清洗器;UV762 型紫外-可見分光光度計。

1.2 實驗方法

準確稱取1.00 g 樺褐孔菌粉，按料液比1 ∶10 g/mL加入異丙醇，在90 Hz、50 ℃的條件下超聲30 min，然后加熱回流提取2 h。減壓過濾，濾液旋蒸除去溶劑。用甲醇定容至50 mL 容量瓶用于含量測定。

1.3 分析方法

1.3.1 標準曲線的繪制 以齊敦果酸為標準品，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸分光光度法進行總三萜含量測定［7-8］。準確稱取齊墩果酸標準品10.0 mg，置于50 mL 容量瓶，用甲醇稀釋至刻度，并搖勻，即得質量濃度為0.2 mg/mL 的標準品溶液。準確移取齊墩果酸標準品溶液0，0. 10，0. 20，0. 30，0. 40，0.50，0.60，0.70 mL，分別加入10 mL 具塞試管中，水浴揮盡溶劑，然后加入0.3 mL 新鮮配制的質量分數5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL 高氯酸，60 ℃水浴中反應20 min，流水冷卻至室溫，加冰醋酸至10 mL，搖勻，在550 nm 波長處測定吸光值。以齊墩果酸質量x 為橫坐標，吸光度y 為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1。

圖1 三萜類化合物標準曲線Fig.1 Standard curve of triterpenoids

由圖1 可知，標準曲線的線性回歸方程為y =3.524 6x－0.002 2，相關系數R2=0.999 2。結果表明，齊墩果酸在0 ～0.14 mg 范圍內與吸光度線性關系良好。

1.3.2 含量測定 準確移取0.1 mL 提取液，水浴揮干，按照繪制標準曲線的操作方法測定樣品在550 nm 波長時的吸光度。

2 結果與討論

2.1 定性分析

三萜類化合物的定性分析采用氯仿-濃硫酸顯色反應［9］，取一定量的樺褐孔菌異丙醇提取物，溶于氯仿，加入濃硫酸，氯仿層呈現紅色，說明有三萜類化合物存在。將氯仿層點樣在濾紙上，在254 nm的紫外分析儀下可以觀察到綠色熒光現象，說明提取液中有三萜類化合物存在。

2.2 單因素實驗

2.2.1 物料比對總三萜得率的影響 物料比對總三萜得率的影響，見圖2。

圖2 物料比對總三萜得率的影響Fig.2 Effects of material-liquid ratio on the yield of total triterpenoids

由圖2 可知，隨著物料比逐漸增大，總三萜得率先增大后減小，在物料比為1∶10 g/mL 時，達到最大值。2.2.2 提取溫度對總三萜得率的影響 提取溫度對總三萜得率的影響，見圖3。

圖3 提取溫度對總三萜得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the yield of total triterpenoids

由圖3 可知，隨著溫度的不斷升高，總三萜得率隨之增加，70 ℃時，得率最高。在70 ～90 ℃的溫度范圍內，得率相對穩定。過高的溫度會對三萜類化合物造成破壞。所以最佳提取溫度選擇80 ℃。

2.2.3 提取時間對總三萜得率的影響 提取時間對總三萜得率的影響，見圖4。

圖4 提取時間對總三萜得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of total triterpenoids

由圖4 可知，總三萜得率隨提取時間的延長先增大后減小，2 h 時達到最大值。原因可能是，提取時間＞2 h 后，雜質也會被溶出到提取溶劑中。

2.2.4 提取次數對總三萜得率的影響 提取次數對總三萜得率的影響，見表1。

表1 提取次數對總三萜得率的影響Table 1 Effect of extraction times on the yield of total triterpenoids

由表1 可知，第一次提取的得率比較高，第二次及第三次的得率低很多。而且，多次提取會嚴重浪費時間和能源，也增加了后續濃縮工藝的難度。因此，提取1 次即可。

2.3 正交實驗結果

在單因素實驗的基礎上，以總三萜得率為考察指標，采用L9(34)正交實驗進行優化。因素水平見表2，結果見表3。

表2 正交實驗因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交實驗結果Table 3 The results of orthogonal test

由表3 可知，影響樺褐孔菌總三萜得率的因素程度大小依次為A ＞B ＞C，即物料比＞提取溫度＞提取時間。最優組合為A2B3C3，即10 倍量異丙醇、提取溫度80 ℃、提取時間2.5 h。

考慮到提取時間對總三萜得率的影響最小，而且＞2 h 后，總三萜得率無明顯增加，從節約時間和能源的角度考慮，工業化生產時可采用10 倍量異丙醇，提取溫度80 ℃，提取時間2 h。

2.5 驗證實驗

為進一步考察最優提取工藝的穩定性，在該條件下，即物料比1∶10 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時間2 h，進行3 次重復實驗，結果見表4。

表4 驗證實驗結果Table 4 The results of proof test

由表4 可知，平均得率為1.42%，相對標準偏差RSD 為2.14%，數據相對穩定，表明該最佳提取工藝合理可行。

3 結論

用異丙醇提取樺褐孔菌總三萜的最佳工藝為:料液比1∶10 g/mL，提取溫度80 ℃，提取時間2 h。采用該提取工藝提取樺褐孔菌總三萜，其得率可達1.42%。

［1］ 黃年來.俄羅斯神秘的民間藥用真菌-樺褐孔菌［J］.中國食用菌，2002，21(4):7-8.

［2］ 李根培，樸惠善.樺褐孔菌化學成分與功能特性的研究進展［J］.中國食用菌，2010，29(4):3-4.

［3］ 張小青，戴玉成. 中國真菌志(銹革孔菌科)［M］. 北京:科學出版社，2005:92-93.

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