長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能影響及抗腫瘤作用研究*

鄧西貝，周 賢，李愛欣，張 楠，翁麗麗，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130012）

長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)荷H22肝腹水瘤小鼠免疫功能影響及抗腫瘤作用研究*

鄧西貝，周 賢，李愛欣，張 楠，翁麗麗，王淑敏**

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130012）

研究長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)荷H22肝腹水瘤小鼠機(jī)體免疫力和抗腫瘤作用的影響。將小鼠除陽性藥組外連續(xù)灌胃給藥6 d，在第7天給每只小鼠右前肢腋下接種H22肝腹水瘤懸液。14 d后，測(cè)定血清中白細(xì)胞介素2（IL-2）和免疫球蛋白G（IgG）的含量，計(jì)算胸腺指數(shù)和抑瘤率，測(cè)定T、B細(xì)胞增殖能力。研究結(jié)果表明，發(fā)酵液和菌絲各劑量組與模型組相比均能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)（p＜0.01）、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖能力（p＜0.01）以及血清中IgG和IL-2的含量（p＜0.01）。長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物能夠提高荷瘤小鼠的免疫力，并對(duì)腫瘤具有一定的抑制作用。

長柄側(cè)耳；白介素；免疫球蛋白；淋巴細(xì)胞

長柄側(cè)耳（Pleurtus spodotecus Fr.） 屬傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬的一種食（藥）用真菌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道子實(shí)體的水提液對(duì)小鼠抑瘤率為72%[1]。近年來癌癥發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，傳統(tǒng)的癌癥治療方法因副作用大，過程痛苦，費(fèi)用高昂，常常給癌癥患者帶來極大的生活負(fù)擔(dān)和身體損傷，因此，毒副作用相對(duì)較小的中藥在癌癥治療領(lǐng)域日漸受到關(guān)注。大量報(bào)道表明，藥用真菌具有抗癌作用[2]，且在治療過程中少見毒副作用，還可以對(duì)傳統(tǒng)放化療治療方法中出現(xiàn)的毒副作用起到輔助治療。本文主要研究長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲對(duì)荷H22腹水瘤小鼠免疫功能的影響及其抗腫瘤作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1試藥的制備

長柄側(cè)耳發(fā)酵液樣品制備：分別準(zhǔn)確稱取長柄側(cè)耳發(fā)酵液干粉20 g、10 g、5 g，分別放于50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，充分溶解，即得發(fā)酵液樣品。長柄側(cè)耳菌絲樣品制備：分別準(zhǔn)確稱取長柄側(cè)耳干燥菌絲20 g、10 g、5 g，加水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，定容至50 mL容量瓶中，即得菌絲樣品。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑

陽性藥CTX（環(huán)磷酰胺），上海華聯(lián)制藥有限公司；小鼠白細(xì)胞介素-2（IL-2）酶聯(lián)試劑盒與小鼠免疫球蛋白（IgG）酶聯(lián)試劑盒，長春百金生物科技股份公司；刀豆蛋白和脂多糖，上海試劑廠；小牛血清，上海立菲生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜，天津市凱利達(dá)化工貿(mào)易有限公司；Hank’s液（配制）、MTT試液（配制）、RPMI1640培養(yǎng)液。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)分析儀，Rayto RT-6000；分析天平，日本島津AUY220；臺(tái)式低速冷凍離心機(jī)，aida公司TDL5M；5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，HeRA公司XB-K-25；光學(xué)顯微鏡，Olympus CX21FS1；高壓蒸汽滅菌鍋LDZX-50KB，上海申安醫(yī)療器械廠；96孔細(xì)胞板、酶標(biāo)板（美國Costar）、小鼠灌胃器、2 mL醫(yī)用注射器、小鼠手術(shù)器械。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康昆明小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1動(dòng)物分組及給藥方案

健康昆明小鼠80只，體重18 g～22 g，實(shí)驗(yàn)前先將小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，然后隨機(jī)分為8組，每組10只，雌雄各半，分別為模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺）、長柄側(cè)耳發(fā)酵液高劑量組（4 g·kg-1）、中劑量組（2 g·kg-1）、低劑量組（1 g·kg-1）、長柄側(cè)耳菌絲高劑量組（4 g·kg-1）、中劑量組（2 g·kg-1）、低劑量組（1 g·kg-1）。各組小鼠均自由進(jìn)食飲水，每3天稱一次體重，按照小鼠的體重灌胃給藥（0.2 mL/10g）。具體方案見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)方案Tab.1 Experimental scheme

2.2小鼠實(shí)體瘤模型的建立

除陽性對(duì)照組外，各組小鼠連續(xù)灌胃給藥6 d。于第7天選擇接種H22肝腹水瘤7 d～10 d的瘤源小鼠，脫臼處死，取腹水制作濃度為1×107個(gè)·mL-1的瘤細(xì)胞液，每只小鼠右前肢腋下皮下注射0.2 mL。接瘤后，陽性對(duì)照組灌胃給藥CTX（環(huán)磷酰胺）0.1 g·kg-1；模型對(duì)照組灌胃給藥生理鹽水；其余各組按表1給藥，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3指標(biāo)測(cè)定

2.3.1 免疫器官質(zhì)量及腫瘤指數(shù)的測(cè)定

連續(xù)給藥14 d后，小鼠摘眼球取血后處死，無菌條件下取出胸腺及腫瘤塊，用生理鹽水沖凈血污，濾紙吸干，精密稱量胸腺和腫瘤塊的重量，計(jì)算胸腺指數(shù)、腫瘤指數(shù)和腫瘤抑制率，胸腺指數(shù)（I，mg·g-1）、腫瘤抑制率（P）公式分別為：

I=m1/m

P=（M-M0）/M×100%

式中：m1表示胸腺重量；m表示體重；M表示模型

組平均瘤重；M0表示給藥組平均瘤重。

2.3.2 淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)的測(cè)定

按照2.3.1處死的小鼠，在無菌條件下取出脾臟，用PBS液沖洗3遍，剪碎研磨，以5 mL Hank’s液制成脾細(xì)胞懸浮液，于無菌離心管中，1 500 r·min-1離心15 min。離心后，再用Hank’s液洗滌2次，棄去上清液，加入RPMI1640培養(yǎng)液，在顯微鏡下，調(diào)整脾細(xì)胞濃度至5×106個(gè)·mL-1。將脾細(xì)胞混懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，每個(gè)樣本設(shè)9個(gè)重復(fù)孔，其中3孔加ConA（終濃度5 μg·mL-1），3孔加脂多糖（終濃度為10 μg·mL-1） 各100 μL，另外3孔用完全RPMI-1640培養(yǎng)液100 μL做空白對(duì)照。置5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)68 h，取出培養(yǎng)板，加入MTT（5 μg·mL-1）10 μL·孔-1，繼續(xù)培養(yǎng)6 h。結(jié)束后，1 000 r·min-1離心10 min，每孔取出100 μL上清液，每孔加入二甲基亞砜100 μL，充分震蕩，37℃放置過夜，酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定OD值。根據(jù)OD值計(jì)算T細(xì)胞增殖指數(shù)（IT）和B細(xì)胞增殖指數(shù)（IB），公式如下：

IT(IB)=OD1(λ)/OD2(λ)

式中：OD1表示實(shí)驗(yàn)孔（Test hole）OD值；OD2表示對(duì)照孔（Comparing hole）OD值。

2.3.3 血清免疫因子含量的測(cè)定

小鼠摘眼球取血后，離心分離血清，根據(jù)相應(yīng)的試劑盒說明書，測(cè)定白細(xì)胞介素2（IL-2）和免疫球蛋白G（IgG）的含量。

2.4數(shù)據(jù)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1不同劑量對(duì)免疫器官及腫瘤形成的影響

小鼠胸腺指數(shù)及抑瘤率測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 小鼠胸腺指數(shù)及抑瘤率Tab.2 Mice thymus indicator and antitumor rate

由表2可知，與模型對(duì)照組相比，長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲各劑量組均能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)（p<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明以長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲灌胃給藥能提高小鼠的免疫力。其中長柄側(cè)耳發(fā)酵液高劑量組（4 g·kg-1）胸腺指數(shù)最高；抑制腫瘤方面以長柄側(cè)耳菌絲低劑量組（1 g·kg-1）效果最好，對(duì)腫瘤的抑制率可達(dá)46.46%。

3.2不同劑量對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)見表3。

由表3可知，與模型對(duì)照組相比，長柄側(cè)耳發(fā)酵液高、中劑量組和菌絲高、低劑量組小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖能力均顯著提高（p<0.01或p<0.05），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。陽性對(duì)照組、發(fā)酵液各組和菌絲高劑量組小鼠B淋巴細(xì)胞的增殖能力均顯著提高（p< 0.01或p<0.05），說明以長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲可以提高小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞的增值能力，其中發(fā)酵液高劑量組（4 g·kg-1）小鼠細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。

3.3測(cè)定結(jié)果對(duì)血清免疫因子的影響

血清中IgG和IL-2的含量情況見表4。

表3 T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)Tab.3 Proliferation indicator of T cell and B cell

表4 血清中IgG和IL-2的含量Tab.4 Content of IgG and IL-2 in serum

由表4可知，長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲各組均能顯著提高小鼠血清中IgG和IL-2的含量（p<0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中菌絲高劑量組（4 g·kg-1）中IgG含量最高，發(fā)酵液高劑量組（4 g·kg-1）中IL-2含量最高。

4 討論

腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展常常伴隨著機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞或者免疫力降低，當(dāng)機(jī)體免疫力下降時(shí)，罹患癌癥幾率會(huì)顯著升高，因此通過提高免疫力，可以更好地預(yù)防、抑制腫瘤的發(fā)生[3-5]。

胸腺是重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化成熟的主要器官，若胸腺發(fā)生萎縮，表示機(jī)體的免疫系統(tǒng)受到抑制，免疫力降低，相反若胸腺指數(shù)增加，則可表明機(jī)體免疫力得到提升。將長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲給藥荷瘤小鼠后，均能顯著提高小鼠的胸腺指數(shù)，說明長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲均能提高荷瘤小鼠的免疫力。

脾臟是重要的外周免疫器官，承載著大量的免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞等。T細(xì)胞是一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，由胸腺產(chǎn)生，表達(dá)IL-10等免疫抑制因子，細(xì)胞表面表達(dá)IL-2受體Ot鏈（CD25），本身不產(chǎn)生IL-2，T細(xì)胞主要是通過細(xì)胞——細(xì)胞接觸依賴方式發(fā)揮免疫抑制作用，在調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生、炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[6]。B細(xì)胞可對(duì)抗原進(jìn)行識(shí)別，經(jīng)活化、增殖后分泌出抗體，參與體液免疫。這兩種細(xì)胞的增殖能力可直接反應(yīng)出機(jī)體免疫力的高低。實(shí)驗(yàn)采用ConA和LPS對(duì)小鼠脾臟中的T細(xì)胞和B細(xì)胞進(jìn)行刺激，測(cè)定其增殖能力，發(fā)現(xiàn)給予長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲的小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖能力均顯著提高，再次印證了長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲具有提高荷瘤小鼠免疫力的功效。

白細(xì)胞介素-2，也稱T細(xì)胞生長因子，能促進(jìn)所有T細(xì)胞的分化成熟，同時(shí)對(duì)B細(xì)胞的活化增殖也有促進(jìn)作用。免疫球蛋白G能夠?qū)C(jī)體的免疫系統(tǒng)起到防護(hù)作用。這兩種物質(zhì)在體內(nèi)含量的高低可以直接影響機(jī)體免疫力的高低。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲提取物的小鼠血清中免疫球蛋白G和白介素-2的含量均顯著提高，同樣也證明了長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲能夠提高荷瘤小鼠的免疫力。

不同劑量對(duì)接種了H22肝腹水瘤的小鼠灌胃給藥長柄側(cè)耳發(fā)酵液和菌絲，可在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)展，其中以菌絲低劑量組抑瘤效果最好，抑瘤率達(dá)到46.46%。

綜上所述，免疫治療的目的是刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的具有腫瘤特異性和細(xì)胞毒性的T細(xì)胞、B細(xì)胞和多種免疫應(yīng)答因子，從而特異性地攻擊腫瘤細(xì)胞[7-8]。長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物能夠提高荷瘤小鼠的免疫力，并且對(duì)H22腹水瘤具有一定的抑制功效，這為進(jìn)一步研究和開發(fā)長柄側(cè)耳提供了依據(jù)。可以考慮將長柄側(cè)耳發(fā)酵產(chǎn)物開發(fā)成與提高免疫力相關(guān)的保健品，或是對(duì)腫瘤治療起輔助作用的藥品。

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草菇是糖尿病患者的良好食品

草菇的維生素C含量高，能促進(jìn)人體新陳代謝，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)抗病能力。它還具有解毒作用，如鉛、砷、苯進(jìn)入人體時(shí)，可與其結(jié)合，形成抗壞血元，隨小便排出。

草菇蛋白質(zhì)中，人體8種必需氨基酸整齊，含量高，占氨基酸總量的38.2%。草菇還含有一種異種蛋白物質(zhì)，有消滅人體癌細(xì)胞的作用。所含粗蛋白含量超過香菇，其他營養(yǎng)成分與木質(zhì)類食用菌也大體相當(dāng)，同樣具有抑制癌細(xì)胞生長的作用，特別是對(duì)消化道腫瘤有輔助治療作用，能加強(qiáng)肝腎的活力。同時(shí)能夠減慢人體對(duì)碳水化合物的吸收，是糖尿病患者的良好食品。

中國食用菌商務(wù)網(wǎng) 2015.01.27

Research on the Influence of Pleurotus spodoleucas Zymotic Product on Organism Immunity and Antitumor Effect of H22 Hepatoma Bearing Mice

DENG Xi-bei,ZHOU Xian,LI Ai-xin,ZHANG Nan,WENG Li-li,WANG Shu-min
(College of Pharmacy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130012,China)

The influence of Pleurotus spodoleucas Fr.fermentation product on organism immunity and antitumor effect of H22 hepatoma bearing mice were studied.The medicine were administered to mice except the positive medicine group continuously for 6 days,and H22 hepatoma suspension were inoculated to the right forelimb armpit of each mouse on 7th day.After 14 days, the content of IL-2 and IgG in serum and T,B cell proliferation capacity were determined,and thymus index and tumor inhibition rate were calculated.Compared with model group,zymotic fluid and hypha distinct dose groups could obviously increase mouse thymus index (p＜0.01),T lymphocyte and B lymphocyte proliferation capacity (p＜0.01)and IgG and IL-2 content in serum(p＜0.01).Pleurotus spodoleucas Fr.fermentation product could increase immunity of hepatoma bearing mouse,while possesses certain inhibiting effect on tumor.

Pleurotus spodoleucas Fr.;interleukin;immunoglobulins;iymphocytes.

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0052-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.014

吉林省科技廳項(xiàng)目（201205050）。

鄧西貝（1986-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴幧锛夹g(shù)。E-mail:564757205@qq.com

**通信作者：王淑敏（1965-），女，博士，教授，主要從事中藥生物技術(shù)方面研究。E-mail:446097156@qq.com

2014-12-23