蛹蟲草菌絲體多糖體外抗氧化活性研究*

張命龍，焦春偉，謝意珍，2**，梁慧嘉，張 松

(1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510663；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

蛹蟲草菌絲體多糖體外抗氧化活性研究*

張命龍1，焦春偉1，謝意珍1，2**，梁慧嘉1，張 松3

(1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510663；3.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631)

通過搖瓶液體發(fā)酵獲得蛹蟲草菌絲體，采用脫脂、水提醇沉、去蛋白、脫色素、透析和冷凍干燥等一系列手段提取蛹蟲草菌絲體多糖。利用羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·） 和1，1—二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)蛹蟲草菌絲體多糖體外抗氧化活性。結(jié)果顯示，蛹蟲草菌絲體多糖對(duì)3種自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除效果，其中對(duì)DPPH的清除力相對(duì)最強(qiáng)。隨著濃度上升，其抑制自由基的效果均增強(qiáng)，呈現(xiàn)劑量正相關(guān)。該多糖對(duì)3種不同自由基抑制作用的IC50值分別為7.01 mg·mL-1、19.90 mg·mL-1和3.51 mg·mL-1。蛹蟲草菌絲體多糖表現(xiàn)出良好的體外抗氧化活性。

蛹蟲草；菌絲體；多糖；自由基；抗氧化

生物體在氧化代謝過程中不可避免會(huì)產(chǎn)生許多活性自由基，其呈游離狀態(tài)，帶有未配對(duì)電子，包括羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）、單線態(tài)氧（1O2）及過氧化氫（H2O2）等[1]。當(dāng)機(jī)體抗氧化能力下降時(shí)，這些自由基容易攻擊蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞機(jī)體正常的生理功能，甚至誘發(fā)各種疾病。

近些年研究發(fā)現(xiàn)，食（藥）用真菌中有不少種類具有天然的抗氧化能力，具體表現(xiàn)為可清除或抑制體內(nèi)外的活性自由基。研究顯示白靈菇、杏鮑菇和阿魏菇多糖提取物均具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性[2]。姬松茸多糖也具有一定的抗氧化能力[3]。靈芝多糖肽在體內(nèi)外均有抗氧化作用，其作用機(jī)制與清除自由基及提高機(jī)體谷胱甘肽過氧化物酶活性有關(guān)[4]。有研究者從鮑魚菇子實(shí)體中分離出一種新的多糖肽，證實(shí)具有較高的體外抗氧化活性[5]。雙孢蘑菇的乙醇提取物在體外可清除自由基，體內(nèi)可顯著提高小鼠體內(nèi)抗氧化酶的活性[6]。有關(guān)食（藥）用菌活性物質(zhì)抗氧化的研究至今仍受研究者們關(guān)注。

蛹蟲草（Cordyceps militaris）又稱北冬蟲夏草、北蟲草，是蟲草屬（Cordyceps）一種，蛹蟲草與聞名于世的冬蟲夏草為同屬異種，含有多種生理活性物質(zhì)，如多糖、蟲草素、蟲草酸、甾醇類等[7]。蛹蟲草具有抗腫瘤、抗菌、降血糖、提高免疫力、清除氧自由基和抗疲勞等藥理作用[8]。其中，多糖是蛹蟲草重要的生理活性物質(zhì)。Rao等[9]研究表明蛹蟲草多糖能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Lee等[10]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草多糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO以及細(xì)胞因子（IL-1和TNF-a），從而激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)抵抗力[10]。但是有關(guān)蛹蟲草菌絲體多糖抗氧化作用的研究暫未有相關(guān)進(jìn)展。本文通過液體發(fā)酵的方法獲得了蛹蟲草菌絲體并提取多糖，采用羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)其體外抗氧化活性，以期為蛹蟲草多糖活性的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 供試菌株

蛹蟲草（C.militaris）1號(hào)菌株，由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖 20 g、蛋白胨 1 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、(NH4)2SO41 g、瓊脂20 g，水1 000 mL，pH 6.5。

液體培養(yǎng)基：蔗糖50 g、KNO34 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、維生素B10.05 g，水1 000 mL，pH 6.5。

1.1.3 主要藥品與試劑

濃硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、乙醇、石油醚、葡萄糖、蔗糖及胰蛋白酶等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?, 1-二苯基-2-三硝基苯肼 [1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl,DPPH]（購(gòu)自阿拉丁試劑公司），純度為96%。透析袋（截留分子量8 kD～15 kD）。

羥基自由基和超氧陰離子自由基測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

ZHJH-1109超凈工作臺(tái)，上海智城分析儀器制造有限公司；ZHWY-1112C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；FD5-3真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)西盟國(guó)際公司；UV2450紫外-可見光分光儀，日本島津公司。

1.2蛹蟲草菌絲體多糖的制備

1.2.1 搖瓶液體發(fā)酵

選用500 mL三角瓶，每瓶裝200 mL液體培養(yǎng)基。在無(wú)菌條件下，從活化好的蛹蟲草斜面菌種上挑取4塊～6塊的菌塊，送入已滅菌并冷卻至室溫的上述液體培養(yǎng)基中，封口三角瓶，160 r·min-1，24℃振蕩培養(yǎng)8 d。

1.2.2 多糖的提取

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)離心分離菌絲體和發(fā)酵液。菌絲體60℃烘干后粉碎過40目篩，收集粉末。以粉末與石油醚比為1∶2（W∶V） 混勻，脫去菌絲體粉中的脂質(zhì)。脫脂后的菌絲體粉以料液比1∶25（W∶V），提取溫度75℃，時(shí)間2.5 h，提取2次。合并2次濾液，并濃縮到適當(dāng)體積。濃縮后的菌絲體浸提液加入4倍體積乙醇沉淀。沉淀物經(jīng)胰蛋白酶和Sevage法去蛋白[11]，雙氧水脫色素[12]，透析等常規(guī)純化工藝處理后，真空冷凍干燥獲得蛹蟲草菌絲體多糖（Intracellular Polysaccharides from C.militaris，IPCM）。

1.2.3 多糖含量測(cè)定

苯酚-硫酸法[13]。經(jīng)測(cè)定，多糖含量為66.41%。

1.3IPCM對(duì)自由基的清除實(shí)驗(yàn)

1.3.1 IPCM對(duì)羥基自由基（·OH）清除作用

Fenton反應(yīng)是最常見的產(chǎn)生羥基自由基的化學(xué)反應(yīng)，H2O2的量和Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess試劑顯色，其呈色與·OH的產(chǎn)生量成正相關(guān)。具體操作依據(jù)試劑盒要求進(jìn)行。清除率（R1，%）公式為：

R1=（A對(duì)照—A測(cè)定） /A對(duì)照×100

1.3.2 IPCM對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除作用

模擬機(jī)體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2-·，加入電子傳遞物質(zhì)及顯色劑，使反應(yīng)體系呈現(xiàn)紫紅色。當(dāng)存在抗超氧陰離子物質(zhì)時(shí)，可抑制該反應(yīng)使超氧陰離子自由基O2-·減少，故比色時(shí)顏色變淺。依據(jù)形成物的顏色深淺，計(jì)算出抑制超氧陰離子自由基O2-·能力的強(qiáng)弱。具體操作依據(jù)試劑盒要求進(jìn)行。清除率公式同1.3.1。

1.3.3 IPCM對(duì)DPPH的清除作用

參考Xu的方法[14]，精密吸取不同濃度的多糖待測(cè)液1.0 mL，加入25 mg·L-1DPPH 50%甲醇溶液2.0 mL，搖勻，暗處室溫靜置20 min，在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定吸光度，記As；精密吸取50%甲醇溶液1.0 mL，加入25 mg·L-1DPPH·50%甲醇溶液2.0 mL，搖勻，記A0；精密吸取不同濃度的多糖待測(cè)液1.0 mL，加入50%甲醇溶液2.0 mL，搖勻，記Ab；每個(gè)濃度重復(fù)3次。以50%甲醇溶液校正儀器零點(diǎn)，清除率（R2）公式為：

R2= [1- (As-Ab)/A0]×100

2 結(jié)果與分析

2.1IPCM對(duì)羥基自由基（·OH）的清除活性

羥基自由基（·OH）是細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的生理自由基，化學(xué)性質(zhì)活潑，容易攻擊蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，從而損傷細(xì)胞的正常功能。IPCM對(duì)羥基自由基（·OH）的清除活性見圖1。

圖1 IPCM對(duì)羥基自由基（·OH）的清除活性Fig.1 Scavenging activity of IPCM to hydroxyl radical（·OH）

由圖1可知，隨著IPCM濃度的上升，其對(duì)·OH的清除能力愈強(qiáng)。當(dāng)濃度在2 mg·mL-1～8 mg·mL-1之間，清除能力與濃度幾乎成線性關(guān)系。但濃度低于2 mg·mL-1或高于8 mg·mL-1時(shí)，清除效果增強(qiáng)緩慢。IPCM濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到59.30%。由此可知，當(dāng)供試 IPCM濃度適中時(shí)，對(duì)·OH清除能力較強(qiáng)烈。由計(jì)算得，IPCM清除·OH的IC50值為7.01 mg·mL-1。

2.2IPCM對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除活性

超氧陰離子自由基（O2-·）是一種生理自由基，氧化能力較強(qiáng)。TPCM對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）清除活性見圖2。

圖2 IPCM對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除活性Fig.2 Scavenging activity of IPCM to superoxide radical（O2-·）

由圖2可知，在本實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，IPCM對(duì)O2-·的清除能力隨濃度增大明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出線性相關(guān)。當(dāng)IPCM濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)O2-·的清除率達(dá)到43.09%。由計(jì)算得，IPCM清除O2-·的IC50值為19.90 mg·mL-1。在高濃度下，IPCM清除O2-·的增強(qiáng)趨勢(shì)甚至強(qiáng)于對(duì)·OH的清除力。

2.3IPCM對(duì)DPPH的清除活性

DPPH是一種非生理環(huán)境的自由基，目前被廣泛用來作為體外評(píng)價(jià)抗氧化活性。IPCM對(duì)DPPH的清除活性見圖3。由圖3可知，IPCM對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除活性。在設(shè)定濃度范圍內(nèi)，隨著IPCM濃度增大，清除率相應(yīng)提高，呈現(xiàn)低濃度增長(zhǎng)較慢，中間濃度增長(zhǎng)較快，高濃度趨于穩(wěn)定的現(xiàn)象。IPCM濃度為10 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH的清除率達(dá)到69.39%。由計(jì)算得，IPCM清除DPPH的IC50值為3.51 mg·mL-1。由此可知，相對(duì)3種自由基而言，IPCM對(duì)DPPH的清除活性最高。

圖3 IPCM對(duì)DPPH的清除活性Fig.3 Scavenging activity of IPCM to DPPH

3 討論

蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵周期短、產(chǎn)量大、質(zhì)量高，能在較短時(shí)間內(nèi)獲得大量的發(fā)酵產(chǎn)物菌絲體，從而克服子實(shí)體栽培時(shí)的不足，如生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、難以人工控制、效率較低等。本實(shí)驗(yàn)利用合成培養(yǎng)基進(jìn)行蛹蟲草菌絲體液體發(fā)酵，是區(qū)別于多數(shù)研究者采用半合成或天然培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)方法[15-17]。天然成分固然有利于促使菌絲體大量繁殖和合成更多的多糖，但往往最終提取的多糖活性物質(zhì)可能受到這些原料中復(fù)雜成分的干擾。筆者使用蔗糖作為唯一碳源，可明確后續(xù)提取的多糖是由菌絲體自身合成，進(jìn)行多糖活性物質(zhì)的提取及開展后續(xù)的活性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究亦符合研究目的。

機(jī)體內(nèi)羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）等與多種疾病相關(guān)，已成為醫(yī)學(xué)界的共識(shí)，如機(jī)體衰老、免疫失調(diào)、動(dòng)脈粥樣硬化、惡性腫瘤等[18]。因此，開發(fā)天然抗氧化劑清除機(jī)體自由基對(duì)于相關(guān)疾病的防治意義重大。

蛹蟲草子實(shí)體是提取多糖的重要來源，研究表明子實(shí)體多糖具有較強(qiáng)的體外和體內(nèi)抗氧化活性[19,20]。菌絲體是子實(shí)體生長(zhǎng)的前期階段，同樣可產(chǎn)生諸如多糖類的活性物質(zhì)。本文通過3種自由基清除實(shí)驗(yàn)證實(shí)了蛹蟲草菌絲體多糖具有良好的體外抗氧化活性，這為蛹蟲草液體發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體的開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。然而蛹蟲草菌絲體多糖在生物體內(nèi)是否可以真正起到預(yù)期的抗氧化效果，還需進(jìn)一步深入探究。當(dāng)前，蛹蟲草子實(shí)體已被開發(fā)成多種功能性食品，在改善人體機(jī)能，促進(jìn)人體健康方面發(fā)揮重要作用。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的蛹蟲草菌絲體亦可在增強(qiáng)機(jī)體抗氧化作用、延緩衰老領(lǐng)域有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Antioxidant Activity of Intracellular Polysaccharides from Cordyceps militaris Mycelium in vitro

ZHANG Ming-long1,JIAO Chun-wei1,XIE Yi-zhen1,2,LIANG Hui-jia1,ZHANG Song3
(1.Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co.Ltd.,Guangzhou 510663,China; 2.Guangdong Institute of Microbiology,Guangdong Academy of Sciences,Guangzhou 510663,China; 3.School of Life Sicence,South China Normal University,Guangzhou 510631,China)

In this study,after submerged fermentation of Cordyceps militaris through shake flask culture,mycelium of C.militaris was obtained.By a series of extraction procedures,such as degreasing,concentration,alcohol precipitation,deproteinization,decolorizatio and dialysis,IPCM(intracellular polysaccharides from C.militaris)were prepared via vacuum freeze-drying. Antioxidant activity of IPCM was evaluated by three experiments including scavenging activity of superoxide and hydroxyl radicals and DPPH.The results showed IPCM had certain activity of scavenging superoxide,hydroxyl radicals and DPPH.Among these radicals,scavenging activity to DPPH was highest relatively.As increasing of IPCM concentration,scavenging activity became stronger,with dose-effect relationship.IC50of scavenging rate for these three radicals were 7.01 mg·mL-1,19.90 mg·mL-1and 3.51 mg·mL-1,respectively.IPCM can excert nice antioxidant activity in vitro.

Cordyceps militaris;mycelium;polysaccharides;radicals;antioxidation

S646.9

A

1003-8310（2015）02-0066-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.02.017

粵港關(guān)鍵領(lǐng)域重點(diǎn)突破項(xiàng)目（2012A080107001）；國(guó)家科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)（2013GB2E000360）；廣州市科技惠民專項(xiàng)（2014Y2-00130）。

張命龍（1986-），男，碩士，工程師，主要從事食藥用真菌功能活性成分研究及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)方面研究。E-mail:zhangminglong69@126.com

**通信作者：謝意珍（1975-），女，碩士，研究員，主要從事食（藥）用真菌的研究開發(fā)方面工作。E-mail:Jiao19800205@126.com

2014-12-28