大白菜2個DH系群體遺傳多樣性分析

梁寶萍，宋佳靜，原玉香，張曉偉*，姚秋菊，張 強，趙艷艷

(1.駐馬店市農科院，河南駐馬店463000;2.河南省農業科學院園藝研究所，河南鄭州450008)

大白菜是我國栽培和食用面積最大的蔬菜［1］，其遺傳學和分子生物學研究一直受到高度重視［2］。對于白菜的分類有表型形態的分類，也有從細胞學水平分類［3］，隨著生物技術的發展，采用分子生物學方法研究大白菜起源演化和分類［4－6］較多。研究大白菜遺傳多樣性可以克服雜交組合組配的盲目性和提高育種效率［7］。白菜具有自交不親和的特性，屬于天然異花授粉植物，在自然環境條件下很容易“串粉”［8］。因此，白菜親緣關系復雜，分類多樣化。但通過小孢子培養的大白菜可以獲得單倍體植株［9］，然后通過自然加倍或人工加倍得到DH(雙單倍體)系，不僅不受環境條件的影響，而且可以進行重復試驗不斷固定遺傳信息，有利于拓寬種質資源，克服雜交組合組配的盲目性和提高育種效率。筆者主要利用SSR分子標記的方法，對大白菜的2個DH系群體內遺傳多樣性進行標記，從分子水平上分析DH系群體內的遺傳關系，為大白菜育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試材料為大白菜的2個品種經小孢子培養獲得的2個DH系群體，分別是Y360(60份材料)、YF05(44份材料)，均為河南省農業科學院園藝研究所提供，所有試驗均在河南省農科院園藝所分子生物學實驗室和蔬菜試驗田進行。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。采用CTAB法提取各株系幼嫩葉片DNA。

1.2.2 SSR反應體系及擴增程序。PCR反應總體積為20 μl，其中 dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA 聚合酶 1U，Mg2+2.5 mmol/L，10 × PCR Buffer 2 μl，上下游引物為0.25 μmol/L，模板 DNA 5 μl(10 ng/μl)，ddH2O 補足至 20 μl。PCR 擴增程序:94℃預變性4 min;94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35個循環;最后72℃延伸7 min，4℃保存。

1.2.3 擴增產物的檢測及數據處理。擴增產物用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，AgNO3染色。數據采用人工計帶法，為減小誤差，記錄清晰可辨的條帶，任一位點若有一個或一個以上個體不同于其他個體的位點記為一個多態性位點。對于同一引物的擴增產物，按擴增條帶的有無計算，同一位置上遷移率相同清晰的條帶記為“1”，同一位置沒有條帶記為“0”。建立0/1距陣。

1.2.4 親緣關系分析。據“1.2.3”建立的0/1矩陣，利用DPS 7.05版軟件，形成下三角，構建聚類圖譜。

2 結果與分析

2.1 引物的篩選 通過田間觀察，從大白菜DH系材料中選擇表型性狀差異較大的4份材料，對122對SSR引物進行擴增篩選，從篩選的SSR引物中挑選擴增效果好、多態性好和充分覆蓋全基因組的引物12對(表1)。

2.2 SSR的擴增效果 Y360(60份)總共擴增出37條帶，29條多態帶，多態性比率為78.0%;YF05(44份)總共擴增出41條帶，36條多態帶，多態性比率為87.8%。總體而言，2個DH系群體材料的多態性較好(圖1)，遺傳多樣性較豐富。

表1 引物信息

2.3 大白菜DH群體遺傳多樣性分析 從圖2可以看出，大白菜DH系Y360群體在遺傳距離0.43處分為9個類群，遺傳距離在0～0.71，平均相異系數為0.553 2。大白菜DH系YF05聚類圖(圖3)在遺傳距離為0.70處分為2個類群，遺傳距離在0.08～ 0.77，平均相異系數為0.6313。第一類群材料數量占整個YF05群體的93%，此類群的材料葉面都有茸毛，第二類群材料葉面都無茸毛。

3 討論

該研究的DH系群體內有不同程度的變異，這與王濤濤等［10］研究的2個大白菜DH系群體內遺傳多樣性分析結論相一致。在該試驗中YF05、Y360的多態性比率分別是87.8%，78.0%，表明遺傳變異程度YF05大于Y360。YF05 DH系群體遺傳變異的可能原因有2個:第一，YF05的雙親性狀是兩個極端，如一個雙親的種子顏色是黑色，另一個是黃色;一個葉表沒毛，一個有毛;花色一個是黃色，另一個是白色;抱球類型一個是合抱，另一個是疊抱;一個耐抽薹，另一個易抽薹。第二，2個親本的來源分別是日本和中國。另DH系Y360群體內部有遺傳距離為0的情況(如360-1與Y360-122，Y360-25與Y360-72)。就該試驗而言，遺傳距離為0并不能說明它們之間遺傳背景完全相同，可以認為試驗中所用引物標記的相同位點較多。所用標記引物不能區分此類材料，也可能是所用引物標記的數量性狀位點較近導致遺傳距離較小等原因。對不同作物的遺傳多樣性研究中，遺傳距離為0的情況也存在很多，如在高粱等作物中存在遺傳距離為0 的情況［11］。

圖1 SSR引物KBRH043E對YF05 DH群體的擴增電泳圖譜

圖2 Y360 DH系群體聚類圖

圖3 YF05 DH系群體聚類圖

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