姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NADPH氧化酶保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制研究

崔群力鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NADPH氧化酶保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制研究

崔群力
鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450014

目的 探討小膠質(zhì)細(xì)胞在多巴胺能細(xì)胞損傷中的作用，以及姜黃素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制。方法 選用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C12細(xì)胞，用魚藤酮誘導(dǎo)其損傷建立帕金森病細(xì)胞模型；用姜黃素預(yù)處理4h的BV-2細(xì)胞再經(jīng)魚藤酮處理4h后的細(xì)胞上清液作為條件培養(yǎng)液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC），處理PC12細(xì)胞。應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）檢測(cè)細(xì)胞活力；DCFH-DA染色檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）的水平；Western blotting法檢測(cè)NADPH氧化酶P47-phox亞基在BV-2細(xì)胞膜上的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，經(jīng)姜黃素預(yù)處理的BV-2細(xì)胞ROS水平降低（P＜0.01）；受MCMC處理的PC12細(xì)胞活力增加（P＜0.01）。姜黃素預(yù)處理使結(jié)合到BV-2細(xì)胞膜的NADPH氧化酶P47-phox亞基明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 魚藤酮通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS，損傷多巴胺能細(xì)胞。姜黃素能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的激活，減少ROS的產(chǎn)生，進(jìn)而保護(hù)多巴胺能細(xì)胞。

姜黃素；魚藤酮；PC12細(xì)胞；條件培養(yǎng)液；小膠質(zhì)細(xì)胞；NADPH氧化酶

既往多從多巴胺能神經(jīng)元的角度探索帕金森病（PD）的發(fā)病機(jī)制，自從在PD患者和動(dòng)物模型腦組織中發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)致密部不僅有大量多巴胺能神經(jīng)元缺失，還有膠質(zhì)細(xì)胞的增生［1］，炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病中的作用日益受到重視。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞，通過分泌具有神經(jīng)毒性的ROS在PD中產(chǎn)生致病作用［2］。因此，抑制小角質(zhì)細(xì)胞過度激活所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能代表了PD治療的一個(gè)研究方向。

姜黃素是食用姜黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化作用，能夠調(diào)節(jié)和抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)和遷移［3］。為此，我們采用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)過的PC12細(xì)胞作為細(xì)胞模型，用魚藤酮作用于BV-2細(xì)胞后，含有炎性細(xì)胞因子的條件培養(yǎng)液處理PC12細(xì)胞，觀察PC12細(xì)胞的存活率及凋亡，探討小膠質(zhì)細(xì)胞激活后對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的影響，研究姜黃素抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活及保護(hù)多巴胺能細(xì)胞的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 姜黃素、魚藤酮、購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。PC12細(xì)胞在高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，內(nèi)含10％胎牛血清。在通有5％ CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。細(xì)胞豐度達(dá)70％～80％時(shí)傳代1次，并于細(xì)胞豐度達(dá)70％～80％時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。BV-2細(xì)胞在含10％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在體積分?jǐn)?shù)為5％CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次。細(xì)胞豐度達(dá)70％～80％時(shí)傳代1次，并于試驗(yàn)前更換培養(yǎng)基。

條件培養(yǎng)液處理PC12細(xì)胞：姜黃素預(yù)處理BV-2細(xì)胞4h加入10nmol/L終濃度的魚藤酮共孵育6h，收集培養(yǎng)上清，作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液（microglia conditioned medium with curcumin，MCMC）。實(shí)驗(yàn)前更換PC12細(xì)胞的培養(yǎng)基，將條件培養(yǎng)液加入PC12細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)后24h觀察細(xì)胞存活率及凋亡情況。

1.2 噻唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)PC12細(xì)胞活力 將細(xì)胞濃度1×108～1×109L-1的PC12細(xì)胞，按1×104～1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種（每孔加細(xì)胞懸液90μL）于96孔培養(yǎng)板，每組6個(gè)復(fù)孔。另設(shè)調(diào)零孔不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)基，其他條件相同。魚藤酮組分別加入適量的魚藤酮稀釋液（每孔10μL），使其終濃度為10nmol/L；姜黃素預(yù)處組組（姜黃素藥物終濃度分別為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L預(yù)處理4h后，與魚藤酮終濃度10nmol/L共孵育BV-2細(xì)胞6h，收集培養(yǎng)液作為PC12細(xì)胞的條件培養(yǎng)液）4組，共6組，共孵育6h，對(duì)照組不加任何藥物（每孔終體積100μL）。孵育24h后每孔加入10μL MTT（5mg/mL），37℃，繼續(xù)孵育4h，加入100μL DMSO，振蕩10min至甲月贊顆粒充分溶解，在570nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。

1.3 DCGH-DA染色法檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）水平 DCFH-DA（2＇-7＇-二氯熒光乙酰乙酸鹽）是一種能自由通過細(xì)胞膜染色劑，其本身不發(fā)出熒光，當(dāng)被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化為熒光化合物DCF時(shí)便發(fā)出熒光。通過檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度，反映細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。

分組及藥物處理：姜黃素預(yù)處理組（0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L）4組；魚藤酮組；空白對(duì)照組，共6組。按要求加入姜黃素使其終濃度為0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L預(yù)處理4h后，加入魚藤酮終濃度為10nmol/L，空白對(duì)照組不加任何藥物培養(yǎng)基培養(yǎng)，置37℃5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。按照試劑盒說明書操作，收集細(xì)胞。進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)：波長(zhǎng)488nm氬離子激光，觀察50 000個(gè)細(xì)胞以上——波峰右移，表明活性氧（ROS）含量高。

1.4 Western blotting法檢測(cè)BV-2胞膜NADPH氧化酶的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理：按要求將BV-2分：胞漿蛋白對(duì)照組；膜蛋白對(duì)照組；以上2組不加任何藥物；姜黃素預(yù)處理組（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3組；魚藤酮對(duì)照組組；apocynin對(duì)照組，共7組。不同濃度姜黃素或apocynin（1mmol/L）預(yù)處理4h后按要求加魚藤酮至終濃度10 nmol/L共孵育24h后搜集細(xì)胞。

細(xì)胞裂解提取膜蛋白（采用天然膜蛋白抽提試劑盒ProteoExtract（M-PEK），MERCK，Cat.No：444810）：膜蛋白對(duì)照組；姜黃素預(yù)處理組（0.5μmol/L、1.0μmol/L、5.0μmol/L）3組；魚藤酮對(duì)照組組；apocynin對(duì)照組，以上6組進(jìn)行提取胞膜蛋白。細(xì)胞裂解分離提取漿/核蛋白（采用天然漿/核蛋白分離抽提試劑盒NucBuster Protein Exaction Kit，MERCK，Cat.No：71183-3）：胞漿蛋白對(duì)照組BV-2細(xì)胞進(jìn)行提取胞漿蛋白。SDS-PAGE電泳：每泳道加總蛋白20μg進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5％脫脂奶粉TBST液浸泡3h，Ⅰ抗孵育4℃過夜（抗體稀釋度1∶500），用TBST液洗膜5min×3次，與辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（抗體稀釋度1∶2 000）室溫下孵育1h，用TBST液洗膜5min×3次，將膜放在1mL ECL發(fā)光試劑混合液中孵育約1min，吸掉混合液，保鮮膜固定，X線膠片曝光1～10min，顯影、定影。定影及DAB顯色，將反應(yīng)的顯影條帶掃描，圖像保存入計(jì)算機(jī)，用Bandscan 5.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢測(cè)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析，2組數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞增殖活力的影響 魚藤酮組與對(duì)照組比較，PC12細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；姜黃素預(yù)處理的條件培養(yǎng)液使PC12細(xì)胞活力增加，與魚藤酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如圖1示。

圖1 條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響

2.2 DCGH-DA染色法檢測(cè)BV-2細(xì)胞內(nèi)活性氧類物質(zhì)（ROS）水平 以DCFH-DA熒光強(qiáng)度反映ROS水平，空白對(duì)照組細(xì)胞的ROS水平為（100±9.39）％，應(yīng)用魚藤酮10nmol/L處理24h后，可使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的活性氧，熒光強(qiáng)度增加，細(xì)胞ROS水平升至對(duì)照組的（187.9±20.5）％，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。姜黃素預(yù)處理4h后和10nmol/L魚藤酮共同孵育24h，可拮抗ROS的生成，熒光強(qiáng)度明顯降低，其中1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素的抑制作用最強(qiáng)。與空白對(duì)照組相比，上述各濃度姜黃素預(yù)處理組細(xì)胞ROS水平分別為對(duì)照組的（187.9±20.5）％、（142.9±15.1）％、（137.1±17.6）％和（151.0±16.8）％。0.5μmol/L姜黃素組與魚藤酮組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1.0μmol/L、5.0μmol/L、10μmol/L姜黃素組與魚藤酮組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 Western blotting法檢測(cè)BV-2細(xì)胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基的轉(zhuǎn)移率 膜蛋白對(duì)照組：BV-2細(xì)胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基處于很低水平；魚藤酮組：魚藤酮誘導(dǎo)后，NADPH氧化酶p47phox亞基向胞膜轉(zhuǎn)移，BV-2細(xì)胞胞膜NADPH氧化酶p47phox亞基處于較高水平，與膜蛋白對(duì)照組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；姜黃素預(yù)處理和NADPH氧化酶抑制劑（apocynin）均顯著抑制了NADPH氧化酶p47phox亞基向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移，從而抑制了BV-2細(xì)胞NADPH氧化酶的活性，其中以5.0μmol/L姜黃素抑制作用最強(qiáng)，與魚藤酮組比較差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2。

圖2 姜黃素對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞NADPH氧化酶轉(zhuǎn)移率的影響

3 討論

PD是一種神經(jīng)變性疾病，以中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失為特征。近年來的研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病共有的重要特征。在炎癥反應(yīng)過程中，小膠質(zhì)細(xì)胞是關(guān)鍵因素。小膠質(zhì)細(xì)胞與炎癥反應(yīng)和神經(jīng)毒性有密切關(guān)系。目前認(rèn)為，小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活導(dǎo)致了神經(jīng)變性疾病的慢性進(jìn)展、是PD進(jìn)行性發(fā)展的驅(qū)動(dòng)力［4］。小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)含有NADPH氧化酶，其在炎癥和神經(jīng)變性間起重要作用。小膠質(zhì)細(xì)胞通過NADPH氧化酶產(chǎn)生大量自由基，NADPH氧化酶可能是小膠質(zhì)細(xì)胞源性ROS的原始來源和小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)促發(fā)炎癥信息的一個(gè)重要機(jī)制。當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活時(shí)，NADPH氧化酶胞質(zhì)亞基p47磷酸化后同p67、p40和Rac2結(jié)合轉(zhuǎn)移到胞膜，同結(jié)合與胞膜的亞基細(xì)胞色素b558相結(jié)合，從而裝配成具有活性的酶，催化產(chǎn)生細(xì)胞外過氧化物［5］。NADPH氧化酶不僅產(chǎn)生小膠質(zhì)細(xì)胞外ROS，也是小膠質(zhì)細(xì)胞信息系統(tǒng)的重要成分，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞幾種炎癥介質(zhì)的表達(dá)。因此，阻斷或抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而阻斷炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，從而減緩神經(jīng)變性疾病的進(jìn)展可能是神經(jīng)變性疾病的一個(gè)治療方向。

姜黃素具有抗氧化、抗炎作用，能夠保護(hù)由MPP+、MPTP、6-羥多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)變性；能通過NF-κB信號(hào)通路抑制炎癥因子的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮抗炎作用［6］。為此，我們采用姜黃素預(yù)處理BV-2細(xì)胞觀察魚藤酮誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)及對(duì)PC12細(xì)胞的影響。研究結(jié)果顯示，0.5～10μmol/L姜黃素條件培養(yǎng)液組較魚藤酮組PC12細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)，1.0μmol/L和5.0μmol/L的姜黃素條件培養(yǎng)液對(duì)PC12細(xì)胞活力影響最顯著（P＜0.01）。因魚藤酮是細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ抑制劑，其抑制線粒體對(duì)氧的利用，從而產(chǎn)生大量ROS。另有文獻(xiàn)［7］報(bào)道，魚藤酮可激活BV-2細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶。因此，我們推測(cè)姜黃素可能通過直接清除BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS、抑制魚藤酮誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的激活抑制ROS的產(chǎn)生，從而發(fā)揮保護(hù)多巴胺細(xì)胞的作用。于是，我們測(cè)定了BV-2細(xì)胞內(nèi)的ROS，結(jié)果顯示，姜黃素明顯減少了魚藤酮誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞內(nèi)的ROS的含量，以1.0μmol/L和5.0μmol/L姜黃素作用最強(qiáng)（P＜0.01）。我們分析，BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS的來源可能有：魚藤酮抑制線粒體呼吸鏈利用氧而產(chǎn)生；通過NADPH氧化酶的激活途徑產(chǎn)生；釋放到BV-2細(xì)胞外的ROS向細(xì)胞內(nèi)滲漏或通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。而BV-2細(xì)胞內(nèi)ROS的增多又作為刺激因素激活NADPH氧化酶或促使BV-2細(xì)胞釋放其他炎癥介質(zhì)［8］，進(jìn)而形成惡性循環(huán)。為此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了NADPH氧化酶的活性。結(jié)果顯示，同NADPH氧化酶抑制劑apocynin一樣，姜黃素也顯著抑制了魚藤酮誘導(dǎo)的BV-2胞質(zhì)內(nèi)p47phox亞基向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移，以5.0μmol/L姜黃素的作用最強(qiáng)（P＜0.01），從而減少BV-2細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，保護(hù)多巴胺能細(xì)胞。

本研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)加重了魚藤酮對(duì)多巴胺能細(xì)胞的損傷；姜黃素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞NADPH氧化酶的激活，減少了小膠質(zhì)細(xì)胞源性ROS的生成，及直接清除細(xì)胞內(nèi)ROS，阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞激活的惡性循環(huán)，從而保護(hù)多巴胺能細(xì)胞。

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（收稿2014-07-12）

R-332

A

1673-5110（2015）11-0037-03