γ-谷維素對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子表達(dá)的影響

劉遠(yuǎn)錦，田媛媛，劉 博，李新華，陳婭婭，曾琳娜，楊 濤，林親錄，羅非君,*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長沙 410008）

γ-谷維素對脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7炎癥因子表達(dá)的影響

劉遠(yuǎn)錦1，田媛媛1，劉 博1，李新華2，陳婭婭1，曾琳娜1，楊 濤1，林親錄1，羅非君1,*

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實驗室，湖南長沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南長沙 410008）

利用細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7形成炎癥模型，評價γ-谷維素對巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響。在LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中，添加不同濃度的γ-谷維素，分析培養(yǎng)基中炎癥因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6 （interleukin-6，IL-6）的含量，以及NO2－/NO3－含量，發(fā)現(xiàn)γ-谷維素能抑制炎癥因子的分泌；利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析mRNA表達(dá)水平，確定γ-谷維素能抑制炎癥因子的基因表達(dá)；采用Western blotting分析進一步確定γ-谷維素能抑制炎癥因子的蛋白表達(dá)。綜上所述，γ-谷維素能明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6、NO等分泌和表達(dá)。

γ-谷維素；炎癥；炎癥因子；米糠

米糠是稻谷加工的主要副產(chǎn)物之一，谷維素是米糠提取物之一，可能具有抗炎的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，米糠提取物可以降低Ⅱ型糖尿病大鼠體內(nèi)脂肪組織中的炎癥標(biāo)記物表達(dá)量[1]；非絕經(jīng)期的肥胖女性經(jīng)常攝入糙米能降低體內(nèi)炎癥標(biāo)記物的表達(dá)水平[2]。在臨床醫(yī)療中，谷維素是調(diào)節(jié)植物神經(jīng)的常用藥物，但徐百勝等[3]采用谷維素與柳氮磺吡啶聯(lián)用治療潰瘍性結(jié)腸炎，發(fā)現(xiàn)谷維素能增強抗炎療效，提示谷維素具有抗炎的功能。在佛波酯誘導(dǎo)的小鼠皮炎模型中，谷維素及其主要活性成分均能顯著抑制小鼠的炎癥反應(yīng)[4]。本課題組最近的研究也發(fā)現(xiàn)γ-谷維素可抑制葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠急性和慢性潰瘍性結(jié)腸炎[5]。以上研究結(jié)果揭示谷維素可能具有抗炎作用，但迄今為止，其抗炎的分子機理尚不清楚。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是由脂質(zhì)和多糖由共價鍵相連組成的，它是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要組成部分，當(dāng)機體被細(xì)菌感染或出現(xiàn)敗血癥時，腸道黏膜屏障破壞，導(dǎo)致LPS進入血液，LPS結(jié)合到CD14/Toll樣受體上，促使免疫細(xì)胞大量分泌腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和NO等炎癥因子，導(dǎo)致機體全身性炎癥反應(yīng)[6-7]。本研究采用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7形成炎癥模型，在分子水平探討γ-谷維素對炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7 無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司；γ-谷維素（純度99%） 日本OSHA Haz有限公司；DSS（純度99%）、LPS（純度99%）美國Sigma公司。

高糖DMEM培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 浙江天杭生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光SYBR 北京全式金生物技術(shù)有限公司；鼠IL-1β酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、鼠TNF-α ELISA試劑盒、鼠IL-6 ELISA試劑盒 美國R&D公司；β-actin抗體、IL-1β抗體、TNF-α抗體、IL-6抗體、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）抗體 美國Cell Signaling公司；二抗Anti-rabbit IgG-HRP （SC-2004）、Anti-mouse IgG-HRP（SC-2005） 美國Santa Cruz公司；化學(xué)發(fā)光底物 美國Pierce公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)與分組

RAW246.7巨噬細(xì)胞用含10%胎牛血清、5%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。隔天傳代，生長至80%～90%時，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗兩次，加入0.25%胰酶在37 ℃消化6～8 min，用移液器打散細(xì)胞后1∶2傳代，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。LPS采用純水溶解，γ-谷維素采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的四氫呋喃溶液溶解，再用純水稀釋，使四氫呋喃在培基中最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。培養(yǎng)的RAW246.7細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種于6 孔板，分為4 組進行處理：對照組，單純LPS處理組，高、低濃度γ-谷維素組。高、低濃度γ-谷維素組中分別加入12.5、25 μmol/L γ-谷維素預(yù)處理30 min后加入終質(zhì)量濃度為1 μg/mL的LPS，單純LPS處理組僅加入LPS溶液和四氫呋喃，對照組加入蒸餾水和四氫呋喃，使4 組細(xì)胞培養(yǎng)基中四氫呋喃最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為0.1%，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，分別收集培養(yǎng)基和細(xì)胞做進一步分析。

1.2.2 γ-谷維素對RAW264.7細(xì)胞的毒性

采用四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法測定γ-谷維素和LPS對細(xì)胞是否有毒性作用[8-9]。取對數(shù)生長期的RAW246.7細(xì)胞，消化后吹打均勻，用培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為7×104個/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入2 μL的γ-谷維素溶液，使得四氫呋喃最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，γ-谷維素的終濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。每組設(shè)置5 個重復(fù)孔。輕輕振蕩，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 h后，每孔加入20 μL MTS（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt）溶液。再次培養(yǎng)4 h后，采用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定每個孔的光密度值。

1.2.3 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

TNF-α、IL-6和IL-1β是重要的炎癥因子。按照1.2.1節(jié)方法將RAW246.7細(xì)胞分為4 組并做相應(yīng)處理，每組3 個重復(fù)，培養(yǎng)24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)液，室溫條件下1 000×g離心10 min，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟操作。繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.2.4 NO2－/NO3－含量檢測

巨噬細(xì)胞受到LPS信號的刺激會釋放NO，但NO非常不穩(wěn)定，會形成亞硝酸鹽（NO2－）和硝酸鹽（NO3－）。取對數(shù)生長期的RAW246.7細(xì)胞消化，稀釋成5×105個/mL細(xì)胞懸浮液，接種于24 孔板中，每孔1 mL。24 h后，棄掉舊培養(yǎng)基，加入新培養(yǎng)基，每孔加入LPS使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，加入γ-谷維素使其終濃度分別為12.5、25 μmol/L，四氫呋喃終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%。培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞培養(yǎng)液按照NO試劑盒說明書方法進行操作，測定NO含量（以NO2－/NO3－表示，為NO2－和NO3－的總量）。按照下式計算NO2－/NO3－含量。

式中：20 μmol/L為標(biāo)準(zhǔn)品濃度；n為樣品測定前的稀釋倍數(shù)；空白組為未加細(xì)胞只有培養(yǎng)基的處理。

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）分析基因mRNA表達(dá)水平

6 孔板培養(yǎng)RAW246.7細(xì)胞，用不同濃度γ-谷維素處理，LPS刺激12 h后，用PBS清洗2 次，以Trizol提取細(xì)胞總RNA，0.8%瓊脂糖膠電泳檢測RNA的完整性并測定其濃度，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA后進行PCR擴增反應(yīng)。iNOS：上游引物5’-CAG CTG GGC TGT ACA AAC CTT-3’，下游引物5’-CAT TGG AAG TGA AGC GTT TCG-3’；TNF-α：上游引物5’-CAA AAT TCG AGT GAC AAG CCT G-3’，下游引物5’-GAG ATC CAT GCC GTT GGC-3’；IL-1β：上游引物5’-GAG CAC CTT CTT TTC CTT CAT CTT-3’，下游引物5’-TCA CAC ACC AGC AGG TTA TCA TC-3’；IL-6：上游引物5’-ATG GAT GCT ACC AAA CTG GAT-3’，下游引物5’-TGA AGG ACT CTG GCT TTG TCT-3’；β-actin：上游引物5’-CCA TAA ACG ATG CCG GA-3’，下游引物5’-CAC CAC CCA TAG AAT CAA GA-3’。qPCR反應(yīng)條件：94 ℃，3 min；94 ℃，30 s；60 ℃，40 s；72 ℃，1 min；40 個循環(huán)。

1.2.6 Western blotting分析

將RAW264.7細(xì)胞用γ-谷維素和LPS處理24 h后，PBS清洗2 次，用含苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）的RIPA裂解液（50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4）、150 mmol/L NaCl、1% NP-40、0.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS））裂解后，5 000×g離心10 min，取上清液。取10 μL蛋白質(zhì)裂解液，直接采用Nanodrop儀測定蛋白質(zhì)濃度，取20 μg的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE），再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將硝酸纖維膜在含有5%脫脂奶粉的PBST（PBS和Tween-20混合）中封閉1 h。一抗孵育過夜（稀釋比例為1∶1 000），孵育后用PBST清洗4 次，室溫條件下二抗孵育2 h（稀釋比例為1∶1 000）。繼續(xù)用PBST清洗4 次。加入化學(xué)發(fā)光底物，X光片曝光、顯影、定影顯示陽性條帶，樣本結(jié)果用看家蛋白β-actin條帶作為內(nèi)參校正。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-谷維素對RAW246.7細(xì)胞的毒性作用分析

如圖1所示，不同濃度γ-谷維素作用于RAW246.7細(xì)胞24 h后，對照組和實驗組細(xì)胞存活率分別為：（100±2.03）%、（103.99±4.98）%、（107.65±9.05）%、（103.58±3.90）%、（111.24±12.15）%、（106.38±6.37）%、（97.96±7.20）%。與對照組相比，不同濃度γ-谷維素處理后，細(xì)胞活力均無明顯改變（P＞0.05），提示0～100 μmol/L的γ-谷維素對RAW264.7細(xì)胞無明顯的毒性作用，該模型可用于后續(xù)實驗。后續(xù)研究將選用1 μg/mL LPS（經(jīng)典處理劑量）刺激RAW246.7細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，采用12.5、25 μmol/L γ-谷維素來評估其抗炎功效及分子機理。

圖1 1 γ--谷維素對RAW264.7細(xì)胞的毒性作用Fig.1 Effect of γ-oryzanol on the viability of RAW264.7 cells

2.2 γ-谷維素對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響

LPS和γ-谷維素處理RAW246.7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心取上清液，測定細(xì)胞炎癥因子的分泌量，結(jié)果見圖2。

圖2 2 γ-谷維素對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響Fig.2 Effect of γ-oryzanol on the production of infl ammatory factors in LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖2所示，ELISA分析結(jié)果顯示，加入LPS刺激后，培養(yǎng)基中IL-1β含量從（15.31±3.12）pg/L增加至（96.32±14.53）pg/L，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中IL-1β含量分別為（40.15±6.56）、（35.31±5.87） pg/L，相對于單純LPS處理組，γ-谷維素處理可極顯著抑制RAW246.7細(xì)胞分泌IL-1β （P＜0.01）（圖2A）。γ-谷維素也能抑制TNF-α的分泌，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中TNF-α含量從（656.32±98.37） μg/L分別降至（475.86±130.78）、（290.62±75.46） μg/L，其中25 μmol/L γ-谷維素處理組與單純LPS處理組相比具有極顯著差異（P＜0.01）（圖2B）。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中，培養(yǎng)基中IL-6含量從（11.13±0.19） pg/L上升至（89.28±3.75） pg/L，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中IL-6含量分別降低至（70.84±1.24）、（61.54±2.78）pg/L（P＜0.01）（圖2C）。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞釋放的NO非常不穩(wěn)定，在培養(yǎng)基中形成會形成亞硝酸鹽（NO2－）和硝酸鹽（NO3－），NO測定試劑盒將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，確定培基中NO的釋放量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)γ-谷維素亦能抑制NO的釋放，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，培養(yǎng)基中NO2－/NO3－濃度從（135.47±4.85）μmol/L分別降至（90.48±9.48）、（64.06±4.53）μmol/L（P＜0.01）（圖2D）。

2.3 γ-谷維素對細(xì)胞炎癥因子和iNOS mRNA表達(dá)水平的影響

如圖3所示，單純LPS處理RAW246.7細(xì)胞12 h后，IL-1β mRNA相對表達(dá)量從1.00±0.31增加至15.31±3.12，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細(xì)胞的IL-1β mRNA相對表達(dá)量分別為10.02±1.82和5.12±1.09，相對于單純LPS處理組，γ-谷維素處理可極顯著抑制IL-1β mRNA轉(zhuǎn)錄（P＜0.01）。γ-谷維素也能抑制TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細(xì)胞的TNF-α mRNA相對表達(dá)量從4.08±0.41（單純LPS處理組）分別降至2.61±0.54 和1.81±0.31，與單純LPS處理組相比具有極顯著差異（P＜0.01）。LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中，IL-6 mRNA相對表達(dá)量為4.57±1.38，12.5、25 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細(xì)胞的IL-6 mRNA相對表達(dá)量分別降至2.25±0.47和1.96±0.45。在炎癥反應(yīng)中，iNOS高表達(dá)是促使炎癥因子NO釋放的重要條件之一，本研究發(fā)現(xiàn)，γ-谷維素亦能抑制iNOS基因的轉(zhuǎn)錄，12.5 μmol/L γ-谷維素處理后，RAW246.7細(xì)胞的iNOS mRNA相對表達(dá)量從8.07±1.54下降到6.01±1.82 （P＜0.05）；25 μmol/L γ-谷維素處理后，iNOS mRNA相對表達(dá)量則降至3.17±1.25（P＜0.01）。

圖 33 γ-谷維素對LPS刺激RAW264.7細(xì)胞炎癥因子和iiNNOOSS mRNA表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of γ-oryzanol on mRNA expression of infl ammatory factors and iNOS in LPS-stimulated RAW264.7 cells

2.4 γ-谷維素對炎癥因子和iNOS蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 Western blotting分析γ-谷維素細(xì)胞炎癥因子和iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of γ-oryzanol on protein expression of infl ammatory factors and iNOS in LPS-stimulated RAW264.7 cells

如圖4所示，Western blotting分析結(jié)果表明，LPS處理RAW246.7細(xì)胞24 h后，IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS蛋白表達(dá)水平明顯上升，而在對照組（0、0）中其表達(dá)水平非常低。與單純LPS處理組相比，γ-谷維素處理后，RAW246.7細(xì)胞中各種炎癥因子水平均有所下降。

3 討 論

炎癥是機體針對外界病毒、化學(xué)物質(zhì)入侵而發(fā)起的維持機體穩(wěn)態(tài)的自發(fā)反應(yīng)。大量研究表明，炎癥因子的異常激活與眾多疾病有密切的關(guān)系[10-11]。如有研究表明慢性炎癥與癌變密切相關(guān)，參與機體的癌變演進[12-13]。Sun 等[14]研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子的高表達(dá)與癌細(xì)胞的藥物抗性密切相關(guān)，IL-6的高表達(dá)可以提高乳腺癌患者對他莫昔芬（一種抗雌激素）的耐藥性。潰瘍性結(jié)腸炎是一種常見的慢性炎癥，其病因復(fù)雜，常反復(fù)發(fā)作并逐漸加重，在潰瘍性結(jié)腸炎組織中存在大量炎癥因子的表達(dá)。因此，對炎癥因子的調(diào)控具有非常重要的意義，特別是利用食品中的營養(yǎng)成分來控制炎癥因子的表達(dá)具有副作用少等突出優(yōu)點。

γ-谷維素主要存在于米糠油及其油腳中，米糠層中γ-谷維素的含量為0.3%～0.5%。在加溫壓榨米糠時，γ-谷維素溶于油中，一般毛糠油中γ-谷維素的含量約為2%～3%。隨著研究的深入，目現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)γ-谷維素具有多種藥理活性，如抗氧化、降脂、調(diào)節(jié)機體植物神經(jīng)紊亂等[15-18]。本研究以RAW246.7巨噬細(xì)胞為材料，明確了γ-谷維素對LPS刺激細(xì)胞所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，為γ-谷維素抗炎功效研究提供了新的實驗依據(jù)。當(dāng)前已有醫(yī)生在臨床上將γ-谷維素用于患者的抗炎輔助治療中[3,19]，但還亟需提供這方面的實驗依據(jù)支持。

本研究發(fā)現(xiàn)γ-谷維素能抑制主要炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NO等表達(dá)，其抗炎作用體現(xiàn)出了多靶點性。也有研究表明，炎癥因子之間可能會存在一些自我加強的作用，如在正常情況下，細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6基礎(chǔ)分泌量很少，在有外界刺激時，如在感染、創(chuàng)傷、TNF-α影響下，可觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)IL-6釋放或合成[20-21]。NO作為一種重要的細(xì)胞間信息交流調(diào)節(jié)因子，其過量釋放與炎癥的產(chǎn)生有密切關(guān)系，其中iNOS是合成NO重要的限速酶，NO釋放往往與iNOS酶高表達(dá)有關(guān)[20]。關(guān)麗華等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在潰瘍性結(jié)腸炎模型中，iNOS表達(dá)升高，NO釋放量增加。通過對iNOS基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究發(fā)現(xiàn)其基因受核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的調(diào)控[22]。Sakai 等[23]發(fā)現(xiàn)在牛動脈內(nèi)皮細(xì)胞中γ-谷維素能抑制NF-κB的活化，減少細(xì)胞黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)。同時，已有研究證實IL-1β、TNF-α、IL-6和iNOS這4 個基因的啟動子中均存在NF-κB的結(jié)合位點，其表達(dá)受NF-κB活性的調(diào)控[24-27]，提示γ-谷維素也可能通過抑制NF-κB的活化起作用，但需要進一步證實γ-谷維素是否能抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)運及其與順式調(diào)控元件的結(jié)合能力。雖然本實驗證實了γ-谷維素能抑制巨噬細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，但其調(diào)控炎癥因子表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需進一步探索。

本研究利用MTT實驗發(fā)現(xiàn)在0～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，γ-谷維素對巨噬細(xì)胞均無明顯毒性作用，這將有利于今后γ-谷維素相關(guān)功能性食品和保健品的研發(fā)。

總之，本研究在評估γ-谷維素抗炎功效的基礎(chǔ)上，對γ-谷維素抗炎的分子機理進行了初步的探索，明確了γ-谷維素能明顯抑制炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6和NO的分泌和表達(dá)。對其分子機理的深入研究，將促進含γ-谷維素的功能食品及保健品的開發(fā)，同時，也能為人們的膳食方案提供科學(xué)的理論依據(jù)。

[1] CANDIRACCI M, LUISA JUSTO M, CASTANO A, et al. Rice bran enzymatic extract supplemented diets modulate adipose tissue infl ammation markers in Zucker rats[J]. Nutrition, 2014, 30(4): 466-472.

[2] KAZEMADEH M, SAFAVI S M, NEMATOLLAHI S, et al. Effect of brown rice consumption on infl ammatory marker and cardiovascular risk factors among overweight and obese non-menopausal female adults[J]. International Journal of Preventive Medicine, 2014, 5(4): 478-488.

[3] 徐百勝. γ-谷維素、柳氮磺吡啶聯(lián)用治療潰瘍性結(jié)腸炎的療效觀察[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 2(1): 127-128.

[4] YASUKAWA K, AKIHISA T, KIMURA Y, et al. Inhibitory effect of cycloartenol ferulate, a component of rice bran, on tumor promotion in two-stage carcinogenesis in mouse skin[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 1998, 21(10): 1072-1076.

[5] 李輝. 米糠γ-谷維素抗急性腸炎的功能評價及初步機理研究[D]. 長沙: 中南林業(yè)科技大學(xué), 2014: 18-30.

[6] LI Meng, ZHANG Lei, CAI Runlan, et al. Lipid-soluble extracts from Salvia miltiorrhiza inhibit production of LPS-induced inflammatory mediators via NF-κB modulation in RAW 264.7 cells and perform antiinflammatory effects in vivo[J]. Phytotherapy Research, 2012, 26(8): 1195-1204.

[7] RYU S, SHIN J S, CHO Y W, et al. Fimasartan, anti-hypertension drug, suppressed inducible nitric oxide synthase expressions via nuclear factor-kappa B and activator protein-1 inactivation[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 2013, 36(3): 467-474.

[8] CHOU S T, PENG H Y, HSU J C, et al. Achillea millefolium L. essential oil inhibits LPS-induced oxidative stress and nitric oxideproduction in RAW 264.7 macrophages[J]. International Journal of Molecular Science, 2013, 14(7): 12978-12993.

[9] RAETZ C R H, WHITFIELD C. Lipopolysaccharide endotoxins[J]. Annual Review of Biochemistry, 2002, 71: 635-700.

[10] LI Xiaojun, JIANG Jiaye, SHI Songshan, et al. A RG-II type polysaccharide purified from Aconitum coreanum alleviates lipopolysaccharide-induced inflammation by inhibiting the NF-κB signal pathway[J]. PLoS ONE, 2014, 9(6): e99697-e99705. doi: 10.1371/journal.pone.0099697.

[11] LI Weidong, CHEN Cihui, SAUD S M, et al. Fei-Liu-Ping ointment inhibits lung cancer growth and invasion by suppressing tumor inflammatory microenvironment[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2014, 14: 153-159.

[12] LANDSKRON G, de la FUENTE M, THUWAJIT P, et al. Chronic Inflammation and cytokines in the tumor microenvironment[J/OL]. Journal of Immunology Research, 2014. http://dx.doi.org/10.1155/2014/149185.

[13] BALKWILL F，MANTOVANI A. Cancer and inflammation: implications for pharmacology and therapeutics[J]. Clinical Pharmacology & Therapeutics, 2010, 87(4): 401-406.

[14] SUN X, MAO Y, WANG J, et al. IL-6 secreted by cancer-associated fibroblasts induces tamoxifen resistance in luminal breast cancer[J]. Oncogene, 2014, 33(35): 4450-4457.

[15] 田媛媛, 林親錄, 羅非君. 米糠γ-谷維素生理功能研究新進展[J]. 糧食與油脂, 2013, 26(9): 43-46.

[16] 龔院生, 姚惠源. γ-谷維醇清除自由基作用的研究[J]. 中國糧油學(xué)報, 2003, 18(1): 10-12.

[17] ISLAM M S, NAGASAKA R, OHARA K, et al. Biological abilities of rice bran-derived antioxidant phytochemicals for medical therapy[J]. Current Topics in Medicinal Chemistry, 2011, 11(14): 1847-1853.

[18] GOUFO P, TRINDADE H. Rice antioxidants: phenolic acids, fl avonoids, anthocyanins, proanthocyanidins, tocopherols, tocotrienols, γ-oryzanol, and phytic acid[J]. Food Science Nutrition, 2014, 2(2): 75-104.

[19] 雷培森, 趙紅. 甲硝唑、谷維素、維生素B1聯(lián)合治療潰瘍性結(jié)腸炎[J].綜合臨床醫(yī)學(xué), 1995, 4(2): 215-216.

[20] 李昕, 劉佳佳. IL-6對中性粒細(xì)胞在炎癥中作用的影響[J]. 國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊, 2005, 28(5): 277-280.

[21] 關(guān)麗華, 龔玉芳, 張弘, 等. 結(jié)腸康對惡唑酮誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎MPO、NO、iNOS的影響[J]. 中成藥, 2013, 35(4): 669-673.

[22] ATREYA I, ATREYA R, NEURATH M F. NF-κB in infl ammatory bowel disease[J]. Journal of Internal Medicine, 2008, 263(6): 591-596.

[23] SAKAI S, MURATA T, TSUBOSAKA Y, et al. γ-Oryzanol reduces adhesion molecule expression in vascular endothelial cells via suppression of nuclear factor-κB activation[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(13): 3367-3372.

[24] COGSWELL J P, GODLEVSKI M M, WISELY G B, et al. NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site[J]. Journal of Immunology, 1994, 153(2): 712-723.

[25] MATSUSAKA T, FUJIKAWA K, NISHIO Y, et al. Transcription factors NF-IL6 and NF-kappa B synergistically activate transcription of the inflammatory cytokines, interleukin 6 and interleukin 8[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1993, 90(21): 10193-10197.

[26] TREDE N S, TSYTSYKOVA A V, CHATILA T, et al. Transcriptional activation of the human TNF-alpha promoter by superantigen in human monocytic cells: role of NF-kappa B[J]. Journal of Immunology, 1995, 155(2): 902-908.

[27] XIE Q W, KASHIWABARA Y, NATHAN C. Role of transcription factor NF-kappa B/Rel in induction of nitric oxide synthase[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269(7): 4705-4708.

Effect of γ-Oryzanol on the Expression of Lipopolysaccharide-Induced Infl ammatory Factors in Macrophages

LIU Yuanjin1, TIAN Yuanyuan1, LIU Bo1, LI Xinhua2, CHEN Yaya1, ZENG Linna1, YANG Tao1, LIN Qinlu1, LUO Feijun1,*
(1. National Engineering Laboratory for Deep Processing of Rice and Byproducts, College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China; 2. Department of Gastroenterology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China)

In this study, we used macrophage models of lipopolysaccharide (LPS)-stimulated infl ammation to evaluate the effect of γ-oryzanol on the expression of infl ammatory factors. After exposing RAW264.7 cells to different concentrations of γ-oryzanol and LPS, we analyzed the contents of IL-1β, TNF-α, IL-6 and NO2-/NO3-(NO) in the macrophage culturemedium and found that γ-oryzanol could inhibit the secretion of inflammatory factors. Real-time quantitative PCR was employed to analyzed mRNA expression levels of IL-1β, TNF-α, IL-6 and iNOS, and it was found that infl ammatory gene transcriptions were inhibited by γ-oryzanol. Western blotting analysis further confi rmed that γ-oryzanol could decrease the expression of IL-1β, TNF-α, IL-6 and iNOS protein. Our data showed that γ-oryzanol can signifi cantly inhibit the expression and secretion of infl ammatory factors such as IL-1β, TNF-α, IL-6 and NO.

γ-oryzanol; infl ammation; infl ammatory factor; rice bran

R284.1

A

1002-6630（2015）19-0238-06

10.7506/spkx1002-6630-201519043

2014-11-13

湖南省教育廳科學(xué)研究重點項目（13A124）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（122-0035）；

中南林業(yè)科技大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項目（CX201313357；CX2013B358；CX2013B14）

劉遠(yuǎn)錦（1990-），女，碩士研究生，研究方向為食品分子營養(yǎng)學(xué)。E-mail：312334609@qq.com

*通信作者：羅非君（1968-），男，研究員，博士，研究方向為食品分子營養(yǎng)學(xué)。E-mail：luofeijun@hotmail.com