乳酸菌中毒素-抗毒素系統研究進展

徐 謂，李洪軍，賀稚非

（西南大學食品科學學院，重慶 400716）

乳酸菌中毒素-抗毒素系統研究進展

徐 謂，李洪軍，賀稚非*

（西南大學食品科學學院，重慶 400716）

毒素-抗毒素系統（toxin-antitoxin system，TAS）是廣泛存在于細菌和古細菌中的一類小型功能基因。目前已發現的TAS分為五大類型。超過75種乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）中的TAS被測定，TAS調控基因（改變細菌鞭毛類型、控制毒素毒性等）、應激環境下調節細菌代謝、在高濃度抗生素作用下形成持留細胞等調控機制已有較深入研究。本文概述近年來TAS分類發展及乳酸菌中TAS的研究情況，為深入研究乳酸菌中TAS并應用于食品工業提供理論依據。

乳酸菌；毒素-抗毒素系統；應用

目前，已經測定的乳酸菌基因序列超過75 種，近80 個乳酸菌的基因序列測定工作正在進行[1]。乳酸菌基因序列的測定使得越來越多的益生菌功能基因被發現[2]。2005年，S iezen等[2]對用于奶酪生產抗噬菌體菌株乳酸鏈球菌（Lactobacillus lactis）SK11中的4 個質粒進行測序，首次發現其中有數個適應型基因，這些基因表現出能在基因水平轉移，而基因水平轉移與菌種的許多功能，如馬奶酒中分離得到的干酪乳桿菌靈活的糖利用功能[3]有明顯關聯。這些功能基因的發現為研制新工程菌并應用于食品工業奠定了堅實的理論基礎。

毒素-抗毒素系統（toxin-antitoxin system，TAS）廣泛存在于細菌染色體及質粒上，是細菌中數量龐大的一類小型功能基因[4-5]。近20 a中，細菌TAS一直是研究熱點，主要集中在其生物學作用[6-7]、進化過程[8-9]、分類[10]、鑒定[11]、不同類別TAS的作用機理[12-13]等方面的研究。TAS是細菌基因中較靈活的組成部分，在基因活性調控中有重要意義，可調控毒素毒性、細胞應激反應等，對于維持細菌質粒的垂直遺傳有不可替代的作用。

迄今為止，已發現的TAS分為五大類型，見表1。第一類TAS中，抗毒素為RNA，通過阻止毒素轉錄來阻礙毒素產生，例如hok-sok系統。第二類TAS幾乎存在于所有的細菌和古細菌中[14]。抗毒素為蛋白質，通過與毒素蛋白結合形成復合物來完成阻礙毒素作用于細胞。目前已發現的第二類TAS有10 種以上，例如CcdA-CcdB系統。第三類TAS中抗毒素亦為RNA，但其作用機理不是阻礙毒素基因轉錄，而是直接與毒素蛋白形成復合物，從而抑制其活性。植物病菌歐文氏桿菌中的ToxI-ToxN是典型的第三類TAS[12]。第四類TAS的抗毒素可與毒素競爭性結合毒素在細胞中的靶位，并不直接與毒素形成復合體。CbeA-CbtA編碼的毒素、抗毒素作用于MreB和FtsZ的聚合過程，為第四類TAS[15]。第五類TAS中抗毒素蛋白裂解編碼毒素的mRNA。它由中國科學院南海海洋研究所Wang Xiaoxue等[10]發現，到目前為止，僅此一例。該TAS由抗毒素GhoS和毒素GhoT組成，其中毒素GhoT是一種細胞膜裂解肽，而GhoS為一個單體。GhoS通過特異性切割GhoT mRNA來抑制GhoT的毒性。

表1 TAS分類概括Table 1 Summary of TAS types

此外，TAS研究過程中還觀察到一些特殊現象。TAS基因組成結構一般為抗毒素基因位于毒素基因上游，在hicA-hicB[18]、HigB-HigA[19]以及BrnT-BrnA[20]等系統中，抗毒素基因卻位于毒素基因下游。一般意義上講，TAS由毒素基因和抗毒素基因共同組成，但也有報道部分TAS由一個獨立基因控制[21-22]。存在由3 個基因組成的TAS，其典型例子為ω-ε-ζ。該系統只存在于革蘭氏陽性菌中，且其功能等尚不清楚[23]。抗毒素一般是41～206 個氨基酸組成的肽鏈，毒素一般由31～204個氨基酸組成，毒素通常比相應的抗毒素氨基酸鏈長。但HipB-HipA系統中毒素包含440 個氨基酸，遠多于普通毒素。這些發現打破了原有的認識，為TAS的發現和研究帶來困難。但同時也表明TAS形式的多樣性，為更深入地研究、開發和應用提供科學基礎。

1 乳酸菌中的毒素-抗毒素系統（TAS）

近幾十年，乳酸菌作為益生菌廣泛應用于食品和藥品中。乳酸菌因能耐受胃酸和膽汁酸，存活至腸道，常被用作一些功能蛋白的載體[24]。乳酸桿菌屬中大約有38%的菌帶有質粒[25]，這些質粒因賦予宿主多種特性而引起人們廣泛的研究興趣，例如質粒攜帶的TAS基因可維持細胞質粒的遺傳穩定性。乳酸菌中TAS研究受到了相當的重視，在第二類毒素-抗毒素系統資源網（a webbased resource for type 2 toxin-antitoxin loci in bacteria and archaea，TADB）上可查詢TAS信息的乳酸菌屬菌株共有18 個，兩個干酪乳桿菌菌株Lacto bacillus casei ATCC 334以及Lactobacillus casei BL23均可查詢，在它們的基因中已分別鑒定出了2 個和8 個TAS[26]。乳酸菌屬中，鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）中TAS研究最為成熟。

1.1 鼠李糖乳桿菌中毒素-抗毒素系統

鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）屬乳酸菌屬，是世界上最著名的益生菌之一。臨床實驗表明，鼠李糖乳桿菌可通過多種渠道改善胃腸道功能。目前對鼠李糖乳桿菌的研究主要集中在GG菌株（L. rhamnosus GG，LGG）上，其相關研究文獻多于目前市場上絕大多數益生菌，在TAS相關方面的研究上占有優勢。

基因序列測定結果表明，鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）ATCC 53103與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）ATCC 334有極強的親緣關系[27]，為干酪乳桿菌的亞種。截至2014年2月，已發現的經過主要基因測序的鼠李糖乳桿菌菌株已有14 個，依次為ATCC 21052、HN001、CASL、Lc705、ATCC 8530、LMS2-1、R0011、MTCC 5462、LRHMDP2、LRHMDP3，2 個GG菌株[27]和LOCK908[28]（之前認為是干酪乳桿菌），LR231[29]，它們的來源各不相同。Klimina等[27]分析了10 個鼠李糖乳桿菌菌株11 個基因組中TAS的組成和分布情況，推斷出多種存在于鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）中的TAS。截至目前，已經證實存在于在鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）中的TAS有6 種，其中一種（PemK1-A1Lrh）由TADB報道。Blower等[30]通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分析了取自15 個實驗室分離的鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）的基因，證實了另外5 種（PemK2-A2Lrh、PemK3-RelB2Lrh、Rel-E1Lrh、RelB3-RelE3Lrh和YefM-YoeBLrh）TAS，為鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）中TAS的研究做出了重要貢獻。

1.2 其他乳酸菌中毒素-抗毒素系統

除鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）外，多種乳酸菌屬益生菌中TAS研究有較大進展。2014年，Emma等[31]在唾液乳桿菌（L. salivarius）JCM1046共生的質粒pMP1046A以及pLMP1046中鑒定出數對完整的TAS，并確定其在質粒pMP1046A基因上的位置：170398～170802為毒素基因、170802～171023為抗毒素基因。唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）UCC118中的質粒pSF118-20編碼pemI和pemK的同源物。在特定宿主中，細胞對質粒pSF118-20中抗毒素基因（pemI）和毒素基因（pemK）具有依賴性。該TAS可保證細胞分裂后的穩定性，同時也保障在翻譯過程中產生PemI以維持質粒完整性。當該TAS基因不存在時，新產生的質粒會出現裂口。這表明，PemI在質粒pSF118-20轉錄翻譯過程對其有愈合作用。這解釋了前人無法獲得完整質粒pSF118-20作為基因探針插入唾液乳桿菌（L. salivarius）UCC118的原因。研究者以此作為理論依據設計構造了新的質粒pLS201以引入唾液乳桿菌（L. salivarius）UCC118中[32]。由TAS在細菌質粒中的功能以及目前已經獲得的研究成果可以推知，這些TAS對于JCM1046菌株的穩定性以及其中共存的質粒的穩定遺傳有重要作用，但其具體作用機制及功能尚不明確，有待深入研究。

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）能同時利用六碳糖以及五碳糖發酵產生乳酸，被認為是應用于發酵木質纖維素水解液生產乳酸的潛力菌種[33]。根據戊糖乳桿菌（L. pentosus）KCA1基因序列，可推斷其包含7 種完整的TAS[34]，其中屬于xre/HigA/VapI-HigB家族的TAS對其在抵抗抗生素尤其是氯霉素作用時有重要意義[35]。植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）廣泛存在于蔬菜、豬肉、魚、乳制品等多種食品中[36-39]，經基因測序發現，其模型菌株植物乳桿菌（L. plantarum）WCFS1中僅含有一對完整的TAS[40]，對其功能等尚無研究。

除乳酸菌外，其他的益生菌中TAS的研究也有較大進展，例如乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）中的質粒pEOC01中TAS已有報道。因毒素、抗毒素結構的穩定性有差異--抗毒素相對于毒素較不穩定，在丟失質粒的子代細胞中，抗毒素被誘導水解，釋放毒素從而殺死子代細胞，這一過程稱為分裂后致死效應（postsegregational killing，PSK）。PSK效應選擇性保留繼承親代質粒的細菌，從而保證質粒在細菌中穩定遺傳。乳酸片球菌中的一對基因質粒pEOC01中ORF13～ORF15與釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）質粒pSM19035 中TAS（ω-ε-ζ）的操縱子同源性達99%[41]。這一操縱子控制的TAS（ω-ε-ζ）可影響質粒穩定性從而導致PSK。質粒pSM19035中ORF14類似ε（抗毒素），而ORF15類似ζ（毒素）[42]。糞腸球菌（Enterococcus faecalis）質粒pAD1中控制多肽類毒素Fst及其相似的幾種毒素的TAS也有較深入的研究[43]。

2 乳酸菌中毒素-抗毒素系統的應用進展

TAS對乳酸菌的特性，例如同一TAS基因的不同種乳酸菌中表現出的基因多樣性等研究是其應用的基礎，目前已有一定進展。學者們基于乳酸菌中TAS的特性對其進行開發，目前，乳酸菌TAS已在鑒定乳酸菌種、測定人體益生菌群組成等方面應用。

基因序列測定結果表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）WCSF1和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）C11兩個菌株的pln基因序列完全相同，且其蛋白結構差異也不大。然而，它們基因位點的一端存在差異：WCFS1菌株基因plnGHSTUW后面還有兩個基因（plnXY），而C11菌株卻沒有，plnXY與TAS有極類似于一對TAS基因[44]。WCFS1-pln位點上plnXY的功能尚不清楚，但其可作為區別WCSF1和C11兩個菌株的重要序列。

研究表明，不同肺炎鏈球菌中TAS（yefM-yoeB）抗毒素（yefM）基因編碼同樣的抗毒素蛋白，但其啟動子序列卻有很大不同[45]，這表明TAS基因結構的多態性與細菌菌株具有密切關系。俄羅斯聯邦科學家Alekseeva等[46]利用這種多態性將TAS（RelB-RelE和MazE-MazF）用于乳酸菌種屬的鑒定，并于2011年申請了一項專利。在2012年國際人體微生態大會上，Danilenko等[47]發表了關于利用TAS的多態性來鑒定人體益生菌組成的文章。

3 乳酸菌中毒素-抗毒素系統的研究意義及應用前景

TAS是乳酸菌中重要功能基因，其具體功能及作用機制尚不完全明確，需進行大量的研究以進一步深入了解。乳酸菌中TAS的研究對乳酸菌中菌株的多樣化的元基因組分析以及乳酸菌開發有重要意義，為乳酸菌更好應用于食品工業開拓出廣闊的前景。

在細菌生長的穩定期，如果受到高濃度的抗菌物質作用，TAS可調控細菌形成持留細胞從而得以存活[48]。通過研究TAS對細胞的這一調控作用，可以利用基因手段改善乳酸菌株對外界環境的抵抗能力，比如使其能耐受某些抗生素或是抗菌劑，從而在壓力環境下維持菌群數量穩定；或是使細菌更穩定的遺傳，防止重要特性變異。近年來，白藜蘆醇由于其突出的抗氧化作用而得到食品行業的廣泛關注，但其本身有抑菌作用，若要將其應用于某些帶有益生菌的食品中，可通過改變TAS改善菌株對其耐受性從而得到對白藜蘆醇更優的利用方法。研究乳酸菌種TAS為其更好地應用于食品生產提供依據。

TAS中兩個基因分別控制毒素與抗毒素產生，抗毒素的不穩定性為毒素的積累提供條件。而抑制毒素的產生一方面可維持細胞增長，另一方面降低下游工程難度，提高產品的品質。深入研究乳酸菌中TAS，針對毒素的產生調控或改變其TAS，對于控制發酵過程中毒素的產生以及提高工業菌株品質等有重要意義。當抗毒素被大量水解時，游離毒素可大量產生從而導致細菌程序性死亡（programmed cell death，PCD）。醫學研究中，有學者提出利用TAS可引起PCD開發兩類非直接作用于TAS的抗菌藥物：1）抑制抗毒素基因轉錄；2）抑制葉酸代謝從而引起胸腺嘧啶缺乏[49]。Kolodkin-Gal等[50]研究發現，在大腸桿菌細胞中，mazEF介導程序性死亡需要一種線性五肽的參與，并稱之為胞外致死因子。一般情況下，胞外致死因子EDF可通過使單個細胞死亡來維持群體生存。如果EDF相關理論得到證實，我們可以用同樣的思路探尋其他菌種的胞外致死因子加以利用。如，可以通過防止EDF進入細胞保護有益菌或是通過導入EDF抑制有害菌群生長。Williams等[51]提出可以利用TAS介導的PCD殺死細胞。例如，通過誘導蛋白酶產生加速抗毒素蛋白的水解。毒素-抗毒素基因的啟動子可以產生一種分子阻斷基因轉錄從而斷絕抗毒素蛋白的補給，而Lon以及Clp等蛋白水解酶會降解已經產生的抗毒素，從而使毒素重新產生活性進而殺死細胞。

在發酵食品生產過程中，噬菌體污染是一個頻發的問題。它可能導致生產崩潰，引起巨額經濟損失，甚至反復發生。研究發現，TAS可使細菌對噬菌體產生排斥，Pecota等[52]報道了位于P1質粒上的hok-sok排斥T4噬菌體的現象。通過特異性改變TAS基因，研制抗噬菌體菌株，對于食品中乳品發酵等多個行業具有重大意義。

TAS的多種功能特性使其具有廣闊的應用前景，但目前乳酸菌中TAS的相關基礎研究尚未完善，需進一步開展基礎研究工作，更明確地了解乳酸菌中TAS的遺傳背景、功能特性等，為其應用性研究奠定堅實的理論基礎。

4 乳酸菌TAS應用時應注意的問題

乳酸菌中TAS數量龐大，清楚地了解其進化背景是進行基因改造的基礎。TAS在細菌基因中分布如此之廣的重要原因是其可通過基因水平轉移進行移動[53]。同一菌株中可發現同一TAS的多個拷貝。這成為TAS作為功能基因的優越特性，但同時也可能為其應用于生產實踐帶來菌株遺傳穩定性的問題。TAS可調控細胞在高濃度抗菌劑作用下形成持留細胞得以存活，其在細菌中的基因水平轉移可能導致TAS轉入到有害微生物中引起有害細菌能夠耐受高濃度抗菌劑。目前普遍認為由TAS引起的這一特性不會發展成為耐藥性[15]，但仍須謹慎對待。食品生產中，一般不推薦應用帶有位于染色體轉座子或是質粒上的基因等可傳播的耐抗生素基因的細菌。歐洲食品安全局推薦使用天然帶有抗藥性或是通過基因突變獲得抗藥性的菌株，不推薦通過植入基因獲得抗藥性的菌株[43]。以后在開發工程菌時也應將這一問題納入考慮范圍。

此外，有實驗證明，從同一原始菌株中分離的兩株菌基因測定結果有較大差異[1]。這說明乳酸菌在一定實驗條件下存在基因并不穩定。這提示我們在菌株應用前必須重視菌株的穩定性測試。在一定程度上講，新菌株與野生菌種功能同一性非常重要，一些關聯細菌典型特性的表現型缺失可能會誤導研究者，需引起注意。但是，TAS為一對基因，具有雙穩性，可保證兩個基因同時表達，這又在一定程度上保障了該系統本身的穩定性。

乳酸菌中TAS研究雖已經取得一定成果，且表現出廣闊的應用前景，但仍不足以作為其廣泛應用的支撐依據。有待研究者們對已經提出以及尚未發現的問題進行進一步深入研究和探討，使TAS不再局限于醫學應用，并且能夠更好地服務于食品行業。

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Advances in Toxin-Antitoxin System of Lactic Acid Bacteria

XU Wei, LI Hongjun, HE Zhifei*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China)

As a functional gene, toxin-antitoxin system (TAS) is present widely in bacteria and archaea. Five types of TAS have been discovered until now. The TAS in more than 75 species of Lactobacillus rhamnosus has been identifi ed. TAS could regulate the genes such as changing the type of bacterial flagellum and controlling the toxicity of toxins, change the metabolism of bacteria under stress conditions, and metamorphose cells into persistent cells in medium with high concentration of antibiotics. In this review, we summarize recent progress in studying the TAS of L. rhamnosusin and its classifi cation, aiming to provide a solid theoretical foundation for future research and application in the food industry.

Lactobacillus rhamnosus; toxin-antitoxin syste m (TAS); application

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0260-05

10.7506/spkx1002-6630-201519047

2014-12-09

國家自然科學基金面上項目（31071566）

徐謂（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：xu.wei47@yahoo.com

*通信作者：賀稚非（1960-），女，教授，博士，研究方向為食品科學。E-mail：2628576386@qq.com