重組蛋白LuxS誘導表達及純化條件的優化

楊 杰，張 筠，孟祥晨

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

重組蛋白LuxS誘導表達及純化條件的優化

楊 杰，張 筠，孟祥晨*

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

目的：優化重組蛋白LuxS誘導表達及純化條件，提高具有生物活性的重組蛋白LuxS的表達量，為體外合成自誘導物2（autoinducer-2，AI-2）奠定基礎。方法：采用單因素試驗，優化誘導培養基、誘導溫度、誘導前菌體生物量、誘導時間以及異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）的濃度；采用Ni-NTA Purifi cation System對重組蛋白進行純化，比較Native Elution Buffer 的咪唑濃度和pH值對重組蛋白純化的影響，確定最佳的Native Elution Buffer；對比蛋白與樹脂結合時不同緩沖液的純化效果，選擇最優的結合緩沖液。結果：重組蛋白的最佳誘導表達條件為：以LB培養基為誘導培養基，菌液OD600 nm為0.6～0.8，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導溫度為37 ℃，誘導時間為12 h。采用添加3 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液作為蛋白與樹脂結合的緩沖液，含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作為蛋白洗脫液。使用分離獲得的LuxS蛋白合成的AI-2生物活性約為陽性對照的6 倍。結論：本研究成功優化了重組蛋白LuxS的誘導表達及純化條件，獲得了具有生物活性的重組蛋白，并成功合成了AI-2。

重組蛋白；LuxS；誘導表達；純化；自誘導物2

群體感應是細菌間通過小分子信號分子進行信息交流、感知菌體密度，進而調控相應基因表達的一種機制[1-2]。細菌在生長繁殖過程中會向環境中分泌特定的信號分子，這種信號分子被稱為自誘導物（autoinducers，AI）[3]。許多細菌中存在幾種群體感應系統，研究發現在哈氏弧菌中就存在兩種群體感應系統。這兩種群體感應系統分別利用酰基高絲氨酸內酯（acylhomoserine lactone）和AI-2作為信號分子[4]。以AI-2介導的群體感應系統存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中，因此AI-2是一種種間通用的信號分子[5-7]。

目前發現，所有能夠產生AI-2的細菌中的AI-2合成途徑都是相同的，即都是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）經過3 步酶催化反應生成的[8-10]。S-腺苷甲流氨酸作為甲基供體，脫去甲基后生成S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），SAH經Pfs催化生成S-核糖高半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和腺嘌呤，LuxS催化S-核糖高半胱氨酸生成4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）和高半胱氨酸（homocysteine，HCY）[11-13]。DPD在水溶液中不穩定，自動分子重排形成有活性的AI-2信號分子。通過AI-2的合成途徑知道，LuxS在AI-2的合成過程中起著關鍵酶的作用，是AI-2合成所必需的。本實驗室前期人員成功構建了重組原核表達載體pQE-30-luxS，并在大腸桿菌中成功表達了重組蛋白LuxS[14]，為得到大量LuxS蛋白奠定了基礎。本研究將對重組蛋白的誘導表達、純化條件進行優化，進而提高重組蛋白產量，為體外合成AI-2奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌（Escherichia coli）M15菌株 上海顯益化學科技有限公司；哈氏弧菌（V. harveyi）BB170、哈氏弧菌（V. harveyi）BB120 美國模式培養物集存庫（American Type Culture Collection，ATCC）。

表達載體pQE-30由黑龍江八一農墾大學郭東華老師惠贈。

1.1.2 試劑

Ni-NTA Purification System 美國Invitrogen公司；2,2’-聯喹啉-4,4-二甲酸二鈉（2,2’-biquinoline-4,4-dicarboxylic acid disodium salt，BCA）法蛋白定量試劑盒 北京百泰克生物技術有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactopyranoside，IPTG） 薩默斯（Summus）公司；低分子質量蛋白質Marker 寶生物工程（大連）有限公司；氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、卡那霉素（kanamycin，Kana）、溶菌酶（酶活力＞20 000 U/mg）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fl uoride，PMSF）、咪唑（imidazole）美國Amresco公司；S-腺苷高半胱氨酸（SAH） 美國Sigma公司。

1.1.3 儀器與設備

迷你型垂直凝膠電泳儀、Model 680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；冷凍高速離心機 美國Sigma公司；UVP凝膠成像系統 美國UVP公司；ZHWY200B型全溫度恒溫培養搖床 上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 誘導培養基的確定

將含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15單菌落接種到5 mL含100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana的LB培養基中，37 ℃、150 r/min搖床培養12 h；將培養12 h的菌液按1%接種量分別接種到M9、自誘導、TB、2YT、SOC和LB培養基[15]中（各種培養基均添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana），37 ℃、150 r/min搖床培養，其中M9、TB、2YT、SOC和LB培養基菌液OD600 nm=0.6～0.8時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，自誘導培養基無需添加誘導劑IPTG，于37 ℃、150 r/min誘導20 h后，取1 mL誘導菌液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.2.2 誘導溫度的確定

將培養12 h的含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導表達，分別于25、30、37 ℃，150 r/min誘導20 h后，取1 mL誘導菌液進行SDS-PAGE分析。

1.2.3 誘導前菌體生物量的確定

將培養12 h的含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養基（添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養至菌液OD600 nm分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導表達，于37 ℃、150 r/min誘導20 h后，取1 mL誘導菌液進行SDS-PAGE分析。

1.2.4 誘導時間的確定

將培養12 h的含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導表達，分別于37 ℃、150 r/min誘導4、6、8、10、12、14、16、18、20 h后，取1 mL誘導菌液進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 誘導劑IPTG濃度的確定

將培養12 h的含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養基（添加100 μg/mL Amp 和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入不同濃度的IPTG（終濃度分別為0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mmol/L）進行重組蛋白誘導表達，于37 ℃、150 r/min誘導12 h后，取1 mL誘導菌液進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白LuxS存在形式的檢測

將培養12 h的含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15菌液按1%接種量接種至LB培養基（添加100 μg/mL Amp和25 μg/mL Kana）中，37 ℃、150 r/min培養至菌液OD600 nm=0.6～0.8，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進行重組蛋白誘導表達，37 ℃、150 r/min誘導12 h后，6 000 r/min離心10 min收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）漂洗菌體2 次，將菌體重懸于1/10原體積的PBS中，加入溶菌酶（終質量濃度為1 mg/mL）、PMSF（終質量濃度為100 μg/mL），于37 ℃、150 r/min振蕩孵育1 h，然后液氮反復凍融3 次裂解菌體（每次在液氮中冷凍3 min后，置于37 ℃水浴融化）；14 000 r/min、4 ℃離心10 min，分別收集上清和沉淀，沉淀用PBS漂洗2 次后重懸于原體積的PBS中，將上清和沉淀進行SDS-PAGE分析。

1.2.7 純化條件的優化

按1.2.6節所述方法收集重組蛋白溶液，參照Ni-NTA Purification System說明書分別對重組蛋白LuxS純化過程中Native Elution Buffer的咪唑濃度及pH值進行優化，首先進行咪唑濃度優化，Native Elution Buffer咪唑濃度分別為250、375、500、625 mmol/L（pH 8.0），在得到的最優咪唑濃度水平上對Native Elution Buffer的pH值進行優化，pH值分別為8.0、7.5、7.0、6.5，分別用4 mL和2 mL的Native Elution Buffer先后進行2 次蛋白洗脫，通過SDS-PAGE分析純化效果。

按1.2.6節所述方法收集誘導后菌體，分別進行3 組實驗，樣品分別編號1、2、3號。第1組：將菌體重懸于1/10原體積的PBS中，然后按照1.2.6節所述方法進行菌體裂解，收集上清。參照Ni-NTA Purification System說明書對重組蛋白LuxS進行純化，用4 mL優化后的Native Elution Buffer對重組蛋白LuxS進行洗脫。第2組：按照第1組方法收集裂解上清后，在上清中加入終濃度為3 mol/L的NaCl溶液后，對重組蛋白LuxS進行純化，其他同第1組操作相同。第3組：將菌體重懸于1/10原體積的Native Binding Buffer中，然后按照1.2.6節所述方法進行菌體裂解，收集上清后對重組蛋白LuxS進行純化，其他同第1組操作相同。3 組實驗的純化效果通過SDS-PAGE進行分析。

1.2.8 在優化條件下重組蛋白LuxS的合成

按1.2.6節所述方法收集重組蛋白溶液，在重組蛋白溶液中加入終濃度為3 mol/L的NaCl，參照Ni-NTA Purification System說明書對重組蛋白LuxS進行純化，用4 mL含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）洗脫LuxS蛋白。將洗脫液密封于透析袋（截留分子質量3 500 u）中，置于10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中透析過夜，期間更換幾次透析液。將透析過的蛋白溶液用超濾管（截留分子質量3 000 u）進行濃縮5～10 倍，采用BCA法蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。在10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）中添加1 mmol/L的SAH、1 mg/mL 的Pfs蛋白和1 mg/mL的LuxS蛋白[16]，37 ℃水浴1 h，用超濾管（截留分子質量3 000 u）濾除蛋白，收集濾液，用哈氏弧菌BB170報告菌株檢測AI-2生物活性[17]，以哈氏弧菌BB120無細胞培養上清作為陽性對照，10 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.5）作為陰性對照，將陽性對照中AI-2生物活性定義為100%。

2 結果與分析

2.1 誘導條件的優化

本課題組前期通過聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）克隆出植物乳桿菌KLDS1.0391中的luxS基因，成功將其插入表達載體pQE-30中，構建成重組質粒pQE-30-luxS，并將重組質粒導入E. coli M15中，成功表達出重組蛋白LuxS[14]。為了提高重組蛋白的表達量，本研究從誘導培養基、誘導溫度、誘導前菌體生物量、誘導時間以及誘導劑IPTG濃度5 個方面進行優化[18-20]。

2.1.1 誘導培養基的確定

圖1 誘導培養基對重組蛋白LuxS表達的影響Fig.1 Effect of different induction media on the expression of recombinant protein LuxS

將含有重組質粒pQE-30-luxS的E. coli M15在不同培養基中進行誘導表達，其中LB、2TY、SOC、TB和M9培養基以IPTG作為誘導劑，自誘導培養基以乳糖作為誘導劑。SDS-PAGE分析結果顯示如圖1所示，LB、2YT、TB 和M9培養基均可誘導重組蛋白LuxS的表達，其中LB、2YT和TB培養基誘導效果較好，由于2YT、TB培養基比LB培養基成本高，且LB培養基完全滿足菌體生長與蛋白表達的需要，綜合考慮選擇LB培養基作為誘導培養基。結果表明，LB、2YT和TB培養基作為誘導培養基時，重組蛋白誘導表達量較高，LB、2YT和TB培養基均營養物質豐富，尤其是氮源和碳源豐富，由此說明，培養基成分對重組蛋白的表達有很大的影響。同時，自誘導培養基以乳糖作為誘導劑，沒有誘導重組蛋白LuxS的表達，并且乳糖在培養基中既可作為誘導劑，又能夠作為一種碳源被菌體代謝，所以在誘導過程中也會很不穩定，需要的乳糖劑量也比IPTG高出很多[21]。

圖2 誘導溫度對重組蛋白LuxS表達的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the expression of recombinant protein LuxS

2.1.2 誘導溫度的確定

由圖2可知，重組蛋白LuxS在37 ℃條件下誘導表達量最高（泳道1），選擇37 ℃作為重組蛋白LuxS的誘導溫度。誘導溫度不僅影響菌體的生長，同樣影響著重組蛋白的誘導表達及蛋白的可溶性[22]。一些種類的蛋白在誘導表達時容易出現錯誤性折疊，從而形成包涵體沉淀，而低溫誘導可以有助于蛋白的可溶性表達[23]。本研究中的LuxS蛋白可溶性較好、不易形成包涵體，主要以可溶性蛋白形式存在。37 ℃是大腸桿菌最適的生長溫度，并且從圖2中看出，誘導溫度為37 ℃時LuxS蛋白表達量最高，所以本研究選取37 ℃作為LuxS蛋白的誘導溫度。

2.1.3 誘導前菌體生物量的確定

圖3 誘導前菌體生物量對重組蛋白LuxS表達的影響Fig.3 Effect of bacterial biomass before induction on the expression of recombinant protein LuxS

由圖3可知，誘導前菌體生物量對重組蛋白LuxS誘導表達無明顯影響，所以選擇OD600nm= 0.6～0.8的代謝相對旺盛的對數生長期菌體進行重組蛋白LuxS的誘導表達。此時的菌體生長迅速，代謝旺盛，有利于重組蛋白的表達。

2.1.4 誘導時間的確定

圖4 誘導時間對重組蛋白LuxS表達的影響Fig.4 Effect of induction time on the expression of recombinant protein LuxS

由圖4可知，重組蛋白LuxS誘導表達量在誘導12 h后達到最高，12 h后產量無明顯變化，所以選擇12 h作為重組蛋白LuxS的誘導時間。隨著誘導時間的延長，重組蛋白產量增加，同時菌體內的蛋白酶對重組蛋白的降解也會增加，所以過長時間的誘導對重組蛋白的表達同樣不利。

2.1.5 誘導劑IPTG濃度的確定

圖5 IPTG濃度對重組蛋白LuxS表達的影響Fig.5 Effect of IPTG concentration on the expression of recombinant protein LuxS

由圖5可知，IPTG濃度對重組蛋白LuxS誘導表達無明顯影響，由于高濃度的IPTG對菌株有一定的毒害作用，所以選擇終濃度為0.1 mmol/L的IPTG作為重組蛋白LuxS的誘導劑。IPTG作為一種強誘導劑，在菌體中不能夠被代謝，可以持續地發揮作用，所以少量的IPTG就可以起到很好的誘導效果。采用較低濃度的IPTG可以適當的降低轉錄速率，有利于蛋白的可溶性表達[24]。

2.2 重組蛋白LuxS的存在形式

由圖6可知，重組蛋白LuxS以可溶性蛋白形式存在（泳道4），沉淀中（泳道3）只有少量蛋白殘留。

圖6 重組蛋白LuxS的存在形式Fig.6 Detection of the form of recombinant protein LuxS

2.3 純化條件的優化

圖7 不同Native Elution Buffer對重組蛋白LuxS純化的影響Fig.7 Effect of different types of native elution buffer on the purifi cation effi ciency of recombinant protein LuxS

由圖7A可知，隨咪唑濃度提高，Native Elution Buffer對LuxS蛋白的洗脫效果逐漸提高，咪唑濃度達到500 mmol/L后繼續提高咪唑濃度洗脫效果無明顯差異。所以選定500 mmol/L作為Native Elution Buffer的咪唑濃度。在500 mmol/L咪唑濃度的基礎上繼續優化Native Elution Buffer的pH值，SDS-PAGE分析結果（圖7B）顯示，隨pH值降低Native Elution Buffer對LuxS蛋白的洗脫效果逐漸提高，pH值降至6.5時Native Elution Buffer洗脫效果最好，經4 mL的Native Elution Buffer洗脫后殘留蛋白最少（圖7B的泳道9）。

本研究對重組蛋白的純化條件進行優化。采用Ni-NTA Purification System對重組蛋白進行純化，鎳離子親和樹脂與帶有組氨酸標記的重組蛋白結合，通過漂洗去除雜蛋白后，對目的蛋白進行洗脫回收。重組蛋白的洗脫采用含有咪唑的溶液，咪唑作為一種競爭性取代劑，與重組蛋白競爭樹脂上的結合位點，使重組蛋白得以洗脫[21]。本研究中先采用提高咪唑濃度的方法改善洗脫效果，發現效果并不太理想，進而又采用了降低洗脫液pH值的方法進行優化。較低的pH值可以減弱重組蛋白與樹脂結合位點的作用，從而使重組蛋白更容易被競爭性洗脫[25]。不過過低的pH值對蛋白活性有影響，所以最終確定洗脫液的pH值為6.5。

圖8 不同結合緩沖液對重組蛋白LuxS純化的影響Fig.8 Effect of different types of binding buffer on the purifi cation effi ciency of recombinant protein LuxS

在對洗脫液進行優化的同時，本研究也優化了蛋白與樹脂結合的緩沖液，由圖8可知，在用PBS重懸菌體得到的裂解上清中添加3 mol/L的NaCl后，進行重組蛋白LuxS的純化，獲得的純化效果最好（圖8泳道5）。NaCl可以減弱重組蛋白與樹脂結合位點的結合，從而使重組蛋白在洗脫時更易被洗脫。

2.4 在優化條件下重組蛋白LuxS的合成

圖9 在優化條件下重組蛋白LuxS的誘導表達與純化結果Fig.9 Expression and purifi cation of recombinant protein LuxS

由圖9可知，在優化條件下誘導表達并純化得到重組蛋白LuxS，經透析、濃縮后對LuxS蛋白質量濃度進行測定，獲得的重組蛋白質量濃度為5.23 mg/mL。以SAH為底物，經Pfs和LuxS蛋白催化，合成了具有生物活性的AI-2（圖10），體外合成的AI-2活力約為陽性對照的6 倍，說明純化得到的重組蛋白LuxS具有生物活性。

圖10 AI-2的生物活性Fig.10 Determination of AI-2 activity

通過對重組蛋白誘導表達、純化條件的優化，提高了重組蛋白的產量，獲得了大量的重組蛋白LuxS。以SAH為底物，通過Pfs和LuxS蛋白的催化，成功合成了具有生物活性的AI-2，為后續研究AI-2信號分子的作用奠定基礎。

3 結 論

本研究成功優化了重組蛋白LuxS的誘導表達條件及純化條件，最佳誘導表達條件為：以LB培養基為誘導培養基，菌液OD600 nm為0.6～0.8，IPTG濃度為0.1 mmol/L，誘導溫度為37 ℃，誘導時間為12 h。最佳純化條件為：采用添加3 mol/L NaCl的PBS溶液作為蛋白與樹脂結合的緩沖液，含500 mmol/L咪唑的Native Elution Buffer（pH 6.5）作為蛋白洗脫液對蛋白進行純化。在優化條件下對重組蛋白LuxS進行誘導表達及純化，獲得5.23 mg/mL的重組蛋白LuxS。

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Optimization of Expression and Purifi cation Conditions of Recombinant Protein LuxS

YANG Jie, ZHANG Yun, MENG Xiangchen*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Objective: To optimize the expression and purifi cation conditions of recombinant protein LuxS. Methods: The induction conditions, including medium components, induction temperature, bacterial biomass before induction, induction time and IPTG concentration were optimized by single-factor design. Recombinant protein was purified using Ni-NTA purifi cation system under native conditions. The optimum native elution buffer was determined by comparing the effects of imidazole concentration and native elution buffer pH on purifi cation effi ciency. The optimum binding buffer for protein and resin was determined by comparing the effects of different types of binding buffer on purifi cation effi ciency. Results: The optimum conditions for expression of recombinant protein were determined as follows: when the OD600 nmreached 0.6-0.8, using LB medium as the induction medium, the induction was initiated with 0.1 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 12 h. PBS buffer containing 3 mol/L NaCl was used for the binding of protein and resin. The recombinant protein was eluted with native elution buffer (pH 6.5) containing 500 mmol/L imidazole. The biological activity of the synthesized AI-2 in vitro, which was produced catalytically by Pfs and recombinant protein LuxS obtained in this study, was approximately 6-fold higher than that from the positive control. Conclusion: The expression and purifi cation conditions of recombinant protein LuxS were optimized, and the recombinant protein LuxS with bioactivity was obtained. Finally, AI-2 was synthesized successfully in vitro.

recombi nant protein; LuxS; induced expression; purifi cation; autoinducer-2 (AI-2)

TS201.3

A

1002-6630（2015）19-0170-06

10.7506/spkx1002-6630-201519030

2014-10-21

教育部博士學科點專項科研基金項目（20122325110017）；黑龍江省教育廳科學技術研究（重點）計劃項目（12521Z002）

楊杰（1990-），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：yangjingjie1990902@163.com

*通信作者：孟祥晨（1970-），女，教授，博士研究生，研究方向為食品微生物與生物技術。E-mail：xchmeng@163.com