納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發酵魷魚碎肉的工藝優化

令狐青青，張 雪，童曉倩，王秋萍，羅紅宇，宋 茹

（浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室，浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022）

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發酵魷魚碎肉的工藝優化

令狐青青，張 雪，童曉倩，王秋萍，羅紅宇，宋 茹*

（浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室，浙江海洋學院食品與醫藥學院，浙江 舟山 316022）

為進一步提高魷魚碎肉的利用價值，本實驗以魷魚碎肉作為納豆芽孢桿菌發酵基質，研究料液比、葡萄糖添加量、發酵pH值、發酵時間和發酵溫度對魷魚碎肉發酵效果的影響。在以單因素試驗確定發酵時間72 h和發酵溫度37 ℃的條件后，再對料液比、發酵pH值和加糖量進行三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗分析，以發酵液的氨基態氮含量為響應值，得到納豆芽孢桿菌發酵魷魚碎肉最佳條件為：料液比1∶1.2（m/V）、發酵pH 8.8和加糖量3.13%。在最優發酵條件下，魷魚碎肉發酵液的氨基態氮實際含量達到2.457 mg/mL。氨基酸分析結果顯示魷魚碎肉發酵液富含具有鮮味和甜味特征的谷氨酸（84.141 mg/g）、天冬氨酸（49.480 mg/g）和甘氨酸（49.425 mg/g），達到氨基酸總量的39.05%。必需氨基酸總量為149.320 mg/g，占氨基酸總量的31.86%。Sephadex G25凝膠過濾層析顯示魷魚碎肉納豆芽孢桿菌發酵液由多肽、小肽及游離氨基酸組成。

魷魚碎肉；納豆芽孢桿菌；發酵；響應面法；氨基酸組成；相對分子質量分布

發酵在人類文明史上有著悠久的應用歷史，食物通過微生物的發酵作用，不僅能夠延長保質期，而且發酵作用還可以提高食物的感官品質和營養價值[1-3]。納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）屬細菌科，芽孢桿菌屬，是制備發酵食品常用的一種有益菌，最早分離自傳統發酵豆制品--納豆[4]。1987年Sumi等[5]報道從納豆中提取出對人體無任何毒副作用的溶血栓物質--納豆激酶（nattokinase，NK），積極地推動了國內外對納豆芽孢桿菌及其發酵產物的研究熱潮。

納豆芽孢桿菌除了用于發酵豆制品外，還可用于一些藥用動植物的發酵，如海參、金針菇等經納豆芽孢桿菌發酵后具有溶栓作用[6-7]。近幾年，在大力倡導食物原料綜合加工利用、提高原料“零浪費”背景下，一些食品加工副產物，如：豆粕[8-10]、啤酒糟[11]、米糠[12]等也被用作納豆芽孢桿菌發酵基質，有效地拓寬了納豆芽孢桿菌的應用范圍。納豆芽孢桿菌能夠分泌多種蛋白酶[4,13]，這些蛋白酶能將發酵基質中蛋白質分解為易被人體吸收利用的寡肽和氨基酸，據報道納豆芽孢桿菌發酵制品多具有抗氧化[12,14-16]、抑菌[17-18]、抗癌[19]等生理活性。

魷魚碎肉是魷魚加工過程中產生的邊角料，這些碎肉蛋白質含量高、營養豐富，采用添加商業蛋白酶進行水解的方式可以制備功能型魷魚蛋白酶解液[20-22]，但是商業蛋白酶成本較高。本實驗以魷魚碎肉為發酵基質，結合納豆芽孢桿菌發酵技術以期提高碎肉蛋白的利用價值，在研究發酵影響因素基礎上對發酵工藝條件進行優化，分析發酵液的氨基酸組成和相對分子質量分布，旨在為魷魚碎肉后續的新型應用以及納豆芽孢桿菌發酵水產動物蛋白研究提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魷魚碎肉，由舟山富丹旅游食品有限公司提供，－20 ℃凍藏。

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto） 中國工業微生物菌種保藏管理中心；蛋白胨、瓊脂粉 杭州天和微生物試劑有限公司；酵母浸膏 中國醫藥集團上海化學試劑有限公司；其余化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HWS-270型恒溫恒濕培養箱 寧波東北儀器有限公司；HZQ-B全溫培養搖床 金壇市華城開元實驗儀器廠；LD2X-40BI型立式電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠；722型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；L-8900型氨基酸分析儀 日本東京日立公司；HL-2S型恒流泵、BS-160A自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌凍干菌粉復活

將納豆芽孢桿菌凍干管在無菌條件下開管，用無菌吸管吸取0.5 mL左右LB液體培養基（酵母浸膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 7.0）溶解凍干菌粉，將溶解后菌懸液轉移至盛有5 mL的LB液體培養基試管中，在37 ℃條件下培養24 h，然后再用LB液體培養基轉接2～3 代恢復菌種活力，最后將菌種轉接到LB固體斜面培養基質中，4 ℃條件下冷藏保存。

1.3.2 魷魚碎肉發酵培養基制備

將魷魚碎肉解凍，清洗干凈，加入一定量水后在打漿機中打漿，調節漿液pH值，按照魷魚碎肉質量加入一定量葡萄糖，然后在121 ℃滅菌15 min，得魷魚碎肉發酵培養基，備用。

1.3.3 單因素試驗優化發酵工藝

在發酵工業中常用甲醛滴定法測定發酵液中氨基態氮含量的變化，以了解可被微生物利用的氮源及利用情況，同時甲醛滴定法也反映出蛋白質水解程度[23]。本實驗在250 mL錐形瓶中固定魷魚碎肉發酵培養基裝量為50 g，將1.3.1節中斜面保藏的納豆芽孢桿菌用LB液體培養基活化至菌懸液濃度約為106個/mL，然后根據魷魚碎肉發酵培養基中碎肉質量以2%比例接入相應體積的納豆芽孢桿菌菌懸液。以發酵液的蛋白質含量和氨基態氮含量為指標，分別研究魷魚碎肉發酵培養基中魷魚碎肉質量與水體積比（料液比，m/V）（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）、發酵時間（24、48、72、96 h）、發酵初始pH值（6.0、7.0、8.0、9.0）、葡萄糖添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）和發酵溫度（27、32、37、42 ℃）對魷魚碎肉發酵培養基的發酵效果影響。

1.3.4 響應面優化發酵工藝

在發酵單因素研究基礎上，進行三因素三水平Box-Behnken響應面分析試驗，以發酵液的氨基態氮含量為響應值，采用Design Expert（v ersion 7.1.4, USA）軟件對試驗結果進行Quadratic模型擬合。

1.3.5 蛋白質含量測定

采用考馬斯亮藍法[24]測定。做法如下：取稀釋適當倍數的發酵液1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍試劑（自行配制），振蕩混合，室溫下放置5 min，測定595 nm波長處的吸光度（A），其中蒸餾水代替樣品在同樣反應條件下為調零管，牛血清白蛋白為標準品。

1.3.6 發酵液中氨基態氮含量測定

采用甲醛電位滴定法[23]測定。

1.3.7 氨基酸組成分析

取魷魚碎肉發酵液凍干品（紅褐色，黏稠狀）50 mg，加入15 mL 6 mol/L的HCl溶解，在110 ℃條件下氮氣保護水解22 h，冷卻后轉移至25 mL容量瓶中，定容。取200 μL用55 ℃氮氣吹干，加入1 mL蒸餾水再烘干，反復3 次，再用1 mL的0.02 mol/L HCl溶解，經0.45 μm濾膜過濾后取濾液20 μL上氨基酸分析儀分析。

1.3.8 發酵液的相對分子質量分布

采用凝膠過濾法對魷魚碎肉發酵液的相對分子質量分布進行分析，具體洗脫條件為：發酵液經0.45 μm濾膜過濾，取1.0 mL濾液上Sephadex G25分離柱（1.6 cm×56 cm），去離子水洗脫，流速為1.0 mL/min，每3 min收集一管，逐管檢測280 nm波長處的光密度值，以洗脫體積（mL）為橫坐標，OD280 nm值為縱坐標，采用Origin Pro 8.5繪圖軟件繪制魷魚碎肉發酵液的相對分子質量分布圖。以牛血清白蛋白（Mr68 000）、抑肽酶（Mr6 512）、VB12（Mr1 355）和氧化型谷胱甘肽（Mr613）為相對分子質量標準物質，在相同條件下洗脫，判定魷魚碎肉發酵液的相對分子質量分布范圍。

2 結果與分析

2.1 發酵條件的單因素試驗結果

圖1 納豆芽孢桿菌發酵魷魚碎肉的單因素試驗結果Fig.1 Infl uence of fermentation conditions on protein and amino nitrogen contents

由圖1a可知，當料液比為1∶3（m/V）時，魷魚碎肉發酵液的蛋白質含量最低，而氨基態氮含量則保持在較高水平。納豆芽孢桿菌以魷魚碎肉為營養物質，通過自身分泌蛋白酶將碎肉中的蛋白質水解為多肽、小肽和氨基酸，使得發酵液中氨基態氮含量增加。當料液比為1∶4時，發酵液的氨基態氮含量降低明顯，可能與菌體直接吸收利用小分子肽和游離氨基酸并作為營養物質有關。而當料液比加大到1∶5時，發酵液中氨基態氮含量與料液比1∶4時相比無明顯變化，說明在料液比1∶4～1∶5范圍發酵液的氨基態氮物質產生量與被菌體利用量保持平衡。

當料液比一定時，發酵液中蛋白質含量和氨基態氮含量相互影響更為明顯，如圖1b所示，當發酵時間在24～72 h時，發酵液中蛋白質含量隨著發酵時間的延長而急劇地降低，而氨基態氮含量則是大幅度地增加。當發酵時間大于72 h時，納豆芽孢桿菌分泌的蛋白酶減少，而且菌體也逐漸進入衰亡期，對營養物質需求減少，所以發酵液中蛋白質和氨基態氮含量變化平緩。

由圖1c可知，當魷魚碎肉發酵培養基的pH值為6.0～8.0時，發酵液中氨基態氮含量呈增加趨勢。當發酵pH值為8.0時，發酵液中氨基態氮含量達到最高值，而當pH值為9.0時，雖然發酵液的蛋白質含量與pH 8.0時的蛋白質含量相比無明顯變化，但是氨基態氮含量則明顯降低，可能與pH值過高不利于納豆芽孢桿菌分泌蛋白酶有關。而且菌體又會優先吸收發酵液中小肽和氨基酸小分子物質作為氮素營養，結果加快了發酵液中氨基態氮含量的降低。潘進權[25]曾報道一株高產蛋白酶的納豆芽孢桿菌在優化的培養基上生長繁殖，當發酵起始培養基pH值在8.0～8.5時有利于該菌種發酵產酶。所以，圖1c中pH 8.0時魷魚碎肉發酵液的氨基態氮含量較高，可能與該pH值條件下納豆芽孢桿菌產酶量大或酶活力高有關。

在蛋白發酵基質中加入適當外源糖可以提供菌體生長所需碳源，能加快菌體的生長繁殖速率，促進代謝產物的產生[26]，而發酵液中氨基酸及肽類物質的積累實際上是菌體吸收利用和代謝形成這些產物相互平衡的結果。圖1d結果顯示，當葡萄糖添加量從0.5%增加到1.5%時，發酵液中蛋白質含量幾乎保持不變，但是氨基態氮含量急劇降低，應與菌體快速生長繁殖需要大量氮素營養且發酵液中小分子肽及氨基酸類被優先吸收作為氮素營養有關。當葡萄糖添加量在1.5%～3.0%時，發酵液中氨基態氮含量變化平緩，說明發酵液中氨基態氮類物質處于生成和被菌體利用的動態平衡中。但是當葡萄糖添加量為3.5%時，發酵液中氨基態氮含量急劇地增加，可能與葡萄糖添加量高導致發酵液滲透壓變大，納豆芽孢桿菌的生長繁殖速率變慢，結果氨基態氮物質被菌體吸收利用速率降低，從而造成發酵液中氨基態氮類物質的大量積累。

由圖1e可知，在發酵溫度為37℃時，魷魚碎肉發酵液中蛋白質含量最低，而氨基態氮含量則保持在較高水平，說明該溫度下納豆芽孢桿菌產酶活性高，有效地促進了魷魚碎肉蛋白水解為小肽和游離氨基酸，與文獻報道的納豆芽孢桿菌適宜產酶及發酵溫度35～38 ℃具有一致性[25,27]。

2.2 響應面分析優化發酵條件

在固定發酵時間72 h和發酵溫度37 ℃條件下，選擇料液比、發酵pH值和加糖量進行三因素三水平Box-Behnken響應面試驗分析，因為氨基態氮含量有助于反映蛋白質的水解程度以及菌體吸收利用發酵液中小分子肽和游離氨基酸情況，所以選取氨基態氮含量為響應值，對納豆芽孢桿菌發酵魷魚碎肉條件進行優化。在綜合考慮發酵液中氨基態氮含量變化規律（單因素試驗結果）基礎上，設計料液比、發酵pH值和加糖量的因素水平及編碼值，具體Box-Behnken響應面試驗設計方案及結果見表1。

表1 Box-Behnken響應面試驗設計及結果Table 1 Box-Behnken design with experimental values of amino nitrogen content

對表1結果進行Quadratic擬合，確定氨基態氮含量（Y）與料液比（X1）、發酵pH值（X2）和加糖量（X3）回歸方程為：Y=8.064 34－0.873 53X1－1.163 94X2－0.195 37X3+0.044 33X1X2－0.040 44X1X3+0.090 22X2X3+ 0.045 58X12+0.056 08X22－0.069 96X32。

表2 Box-Behnken響應面試驗方差分析Table 2 Analysis of variance (ANOVA) of response surface quadratic model

對表1結果進行方差分析，結果見表2。模型P值為0.008 8（P＜0.05），具有顯著性，失擬項P值為0.114 8不顯著（P＞0.05），說明該模型能夠預測實際結果。一次項X1和平方項X32對魷魚碎肉發酵效果有顯著性影響（P＜0.05），即：在發酵過程中要嚴格控制料液比和加糖量。此外，由表2還能夠看出，X2X3交互作用P= 0.051 8，略高于0.05，表明發酵pH值和加糖量對發酵液中氨基態氮含量具有一定的交互作用。在固定發酵時間72 h和發酵溫度37 ℃條件下，經擬合得出納豆芽孢桿菌發酵魷魚碎肉最佳條件為：料液比1∶1.2、發酵pH 8.8、加糖量3.13%，該條件下發酵液的氨基態氮理論含量為2.687 mg/mL。在最優發酵條件下進行3 次平行發酵實驗，測定魷魚碎肉發酵液的氨基態氮實際含量平均值為2.457 mg/mL，與模型預測理論值無顯著性差異（P＞0.05），所以響應面法確定的魷魚碎肉蛋白發酵條件比較穩定可靠。

2.3 氨基酸組成分析

表3 魷魚碎肉發酵液的氨基酸組成分析Table 3 Amino acid composition of fermented squid meat

由表3可知，魷魚碎肉發酵液中具有鮮味作用的谷氨酸含量為84.141 mg/g，占測定氨基酸總量的17.95%。另外兩種與鮮味和甜味有關的天冬氨酸（49.480 mg/g）和甘氨酸含量（49.425 mg/g）分別占測定氨基酸總量的10.56%和10.54%。此外，該發酵液中的蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸這7 種必需氨基酸總量為149.320 mg/g，占測定氨基酸總量的31.86%。因此，魷魚碎肉經納豆芽孢桿菌發酵后得到的發酵液不僅呈味氨基酸含量豐富，而且必需氨基酸含量較高，有進一步開發為功能型風味料的應用前景。

2.4 發酵液的相對分子質量分布

圖2 魷魚碎肉發酵液的Sephadex G25凝膠過濾色譜圖Fig.2 Chromatogram profi le of fermented squid meat isolated by Sephadex G25 gel

魷魚碎肉經納豆芽孢桿菌在最優發酵條件下發酵，所得發酵液的凝膠過濾色譜圖如圖2所示，魷魚碎肉發酵液在280 nm波長處有特征吸收峰，且發酵液的茚三酮反應、雙縮脲反應均呈陽性，說明該發酵液含有肽類和游離氨基酸。魷魚碎肉發酵液經Sephadex G25分離得到6 個分離峰，通過與相對分子質量標準物質的凝膠過濾圖譜比較可知：魷魚碎肉發酵液中峰1組分應屬于Mr介于1 500～6 000的多肽類，而其余5 個分離組分（峰2～峰6）應與小肽（Mr＜1 500）和游離氨基酸有關。魷魚碎肉納豆芽孢桿菌發酵液的肽譜解析有待于后續進一步研究。

3 結 論

本實驗采用納豆芽孢桿菌發酵法發酵魷魚碎肉，以期提高其利用價值，通過單因素試驗確定發酵時間72 h和發酵溫度37 ℃條件下，在此基礎上進行響應面優化試驗得出納豆芽孢桿菌發酵魷魚碎肉的最佳發酵條件為：魷魚碎肉發酵培養基料液比為1∶1.2、發酵pH 8.8、加糖量3.13%。在此條件下，魷魚碎肉發酵液的氨基態氮實際含量達到2.457 mg/mL，該發酵液不僅鮮味和甜味風味氨基酸含量豐富，而且必需氨基酸含量高，發酵液中含有多肽、小肽及游離氨基酸。納豆芽孢桿菌一般主要用于豆類食品的發酵，本實驗研究結果表明魷魚碎肉可以作為納豆芽孢桿菌發酵基質，為納豆芽孢桿菌在水生生物蛋白高值化應用方面提供了技術依據。

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Optimization of Fermentation Conditions of Minced Squid Meat by Bacillus natto

LINGHU Qingqing, ZHANG Xue, TONG Xiaoqian, WANG Qiuping, LUO Hongyu, SONG Ru*
(Zhejiang Provincial Key Laboratory of Health Risk Factors for Seafood, College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

In the present study, minced squid meat was used as the fermentation substrate for Bacillus natto to improve the application value of squid minced meat. The effects of liquid-solid ratio (1:2-1:5), glucose concentration (0.5%-3.5%), initial pH (6.0-9.0), fermentation time (24-96 h) and fermentation temperature (27-42℃) on the amino nitrogen content of fermented broth were evaluated. Using one-factor-at-a-time method, the fermentation time and temperature were selected as 72 h and 37 ℃, respectively. Subsequently, three variables including solid to liquid ratio (m/V), initial pH and glucose concentration were optimized by response surface methodology based on Box-Behnken design using the amino nitrogen content of fermented broth as the response. The optimal conditions for solid to liquid ratio, initial pH and glucose concentration were determined as 1:1.2, 8.8 and 3.13%, respectively. Experiments carried out under these conditions led to an amino nitrogen content of 2.457 mg/mL. Moreover, amino acid composition analysis demonstrated that the fermented squid minced meat was rich in glutamic acid (84.141 mg/g), aspartic acid (49.480 mg/g) and glycine (49.425 mg/g). These amino acids were responsible for umami and sweet taste characteristics with total content of 39.05%. The total essential amino acid concentration was 149.320 mg/g, accounting for 31.86% of all determined amino acids. In addition, the relative molecular weight distribution indicated that the fermented squid minced meat was composed of polypeptides, small peptides and free amino acids.

minced squid meat; Bacillus natto; fermentation; response surface methodology; amino acid composition; relative molecular weight distribution

TS254.9

A

1002-6630（2015）19-0148-05

10.7506/spkx1002-6630-201519026

2014-11-20

海洋公益性行業科研專項（201305013）；浙江省科技廳重大科技專項重點農業項目 （2013C02003）；

2013年度國家星火計劃項目（2013GA700260）；舟山市科技計劃項目（2013C41008）

令狐青青（1994-），女，本科生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：952553230@qq.com

*通信作者：宋茹（1976-），女，副教授，博士，研究方向為水產品加工與貯藏、食品化學與營養支持。E-mail：rusong@zjou.edu.cn