高產甘油低產H2S葡萄酒優良酵母菌株篩選及其釀酒特性

宮 雪，江 璐，劉 寧，劉延琳,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊 凌 712100）

高產甘油低產H2S葡萄酒優良酵母菌株篩選及其釀酒特性

宮 雪1，江 璐1，劉 寧1，劉延琳1,2,*

（1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊 凌 712100）

為獲得中國本土優良酵母，提高葡萄酒感官特性，通過對采自新疆鄯善地區、寧夏廣夏三基地的40 株野生酵母菌株進行實驗室釀酒實驗，篩選到兩株高產甘油、低產H2S的葡萄酒優良酵母菌株H02、E22。分別于2010、2011年連續2 a對這2 株菌進行了10～20 L酒廠發酵實驗并研究其釀酒特性。酒樣理化指標結果符合國家標準GB 15037-2006《葡萄酒》要求，感官品嘗分析結果與對照商業酵母V L1、RC212、C2C的差異性不顯著（P＞0.05），感官品質相當，篩選出的野生酵母菌株有著優良的釀酒特性。

甘油；葡萄酒；酵母菌；篩選；釀酒

甘油是酵母菌酒精發酵過程中的正常副產物，主要在葡萄汁發酵初期產生。甘油存在于各類葡萄酒中，在葡萄酒中含量通常為l～15 g/L[1-3]，其甜味閾值為5.2 g/L，是葡萄酒中除水、酒精、CO2以外含量最豐富的成分[4]。甘油具有甜味和黏稠性，由于其甜味和葡萄糖相似[5]，所以葡萄酒中高的甘油含量有利于提高葡萄酒的口感，改善葡萄酒的感官特性，從而顯著影響葡萄酒的質量，尤其對提高干、半干葡萄酒的質量具有重要意義。硫化氫（H2S）是對葡萄酒風味有重要影響的揮發性硫化物，在葡萄酒釀造過程中，釀酒酵母通過硫代謝過程產生痕量的H2S，它的揮發性很強，具有不愉快的氣味，通常被描述為臭雞蛋味、臭鼬味、大蒜味或洋蔥味[6]。因此，提高葡萄酒中甘油含量、降低H2S含量均有利于提高葡萄酒質量。

國內外提高葡萄酒中甘油含量的方法主要有改變發酵條件[7]、熱激法[8-11]、構建高產甘油的基因工程菌[12-13]與適應性演化菌種法[14]，另外，還有混合菌種發酵、改變葡萄汁成分等方法。但這些方法或多或少都存在著一些不足，如熱激法會使葡萄酒中的香氣蒸發而喪失；轉基因技術在食品飲料中的應用有一定限制且會導致某些發酵副產物增加，如琥珀酸酯和醋酸酯[15]；混合菌種發酵導致乙酸等揮發性副產物的增加，給葡萄酒帶來不愉悅的香氣[16]。去除葡萄酒中H2S的工藝主要有銅沉淀法和惰性氣體去除法，銅沉淀法可能會造成葡萄酒中銅離子超標，因此，必須將其降至國家標準允許范圍內；惰性氣體去除法可能會同時帶走其他重要的揮發性物質，從而造成葡萄酒香氣物質的損失。

本研究對分離自新疆鄯善地區、寧夏廣夏三基地的野生釀酒酵母菌株進行實驗室釀酒實驗，從中篩選優良酵母菌株，并進一步對優選菌株進行10～20 L酒廠發酵實驗，研究其釀酒特性。從中國本土野生酵母中篩選高產甘油、低產H2S的葡萄酒優良酵母，對于提高葡萄酒感官質量，釀造具有中國產區特色的葡萄酒具有重要意義，并為后續相關研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

新疆鄯善地區、寧夏廣夏三基地2 個地區的不同葡萄品種自然發酵過程中分離的40 株野生酵母菌株，分離源見表1；對照菌株：商業酵母X16、RC212、VL1、C2C法國Laffort公司；不產H2S釀酒酵母UCD932和高產H2S釀酒酵母UCD819 美國UCDavis大學。

表1 菌株采樣分離記錄Table 1 Details of the isolated strains

1.1.2 試劑

Megazyme甘油檢測試劑盒 英國Megazyme公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：3.25 g 3,5-二硝基水楊酸、2 mol/L氫氧化鈉162.5 mL、22.5 g丙三醇，用蒸餾水定容至500 mL，棕色瓶4 ℃恒溫放置；葡萄酒理化指標檢測試劑的配制和使用參考國家標準GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》；Triple M模擬汁的配制參考文獻[17]。

1.1.3 儀器與設備

MJ-250B型霉菌培養箱 上海躍進醫用光學器械廠；H2S檢測管 上海豫東電子科技有限公司；普通光學顯微鏡 重慶光電儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高產甘油菌株的篩選

小白玫瑰葡萄除梗破碎取澄清汁，檢測總糖含量為187 g/L，總酸含量為6.3 g/L（以酒石酸計），pH值為2.65。將葡萄汁按500 mL/瓶分裝到滅過菌的容量為1 L三角瓶中，添加20 mg/L SO2。每瓶按5×105CFU/mL（本實驗菌落計數方法均采用血球計數板法計數對數期培養的菌株數量）接種量接入小白玫瑰葡萄汁進行擴大培養，每個菌株重復2 次，商業酵母X16為對照菌株。接種量在較小變化范圍內對酵母甘油含量沒有顯著差異變化[18]?？刂茰囟仍?0 ℃條件下進行發酵，每隔12 h稱量失重（發酵糖轉化為CO2氣體損失的質量），監測發酵進程，以72 h凈失質量總和不超過0.5 g作為發酵終點；發酵結束后自然澄清并分離。按GB/T 15038-2006標準檢測每個菌株發酵酒樣的相關理化指標，Megazyme甘油檢測試劑盒檢測甘油含量。

1.2.2 低產H2S菌株的篩選

對1.2.1節中篩選出的高產甘油酵母菌株進一步進行低產H2S特性的相關研究。取500 mL滅菌三角瓶，向其中注入300 mL經過濾除菌的Triple M模擬汁，每瓶按5×105CFU/mL接種量接入模擬葡萄汁活化酵母菌液，用兩孔硅膠冒封好口，其中H2S檢測管通過球形玻璃彎管與發酵罐內部相連，球形玻璃彎管在硅膠冒下方露出2～3 mm，注意要和液面有較大距離，以免在搖床培養時接觸模擬汁，另一孔中插入長不銹鋼注射針頭到發酵液面以下。將小瓶放入搖床中20 ℃、120 r/min進行培養，DNS法檢測還原糖含量監控發酵[19]，還原糖含量低于2 g/L終止發酵，測量H2S檢測管的顯色長度[20]。每菌株3 個重復，不產H2S的釀酒酵母UCD932和高產H2S的釀酒酵母UCD819為對照菌株。

1.2.3 優選菌釀酒特性研究

將篩選出的高產甘油、低產H2S的優選菌在2010、2011年分別在寧夏御馬酒廠、山西戎子及甘肅莫高酒廠進行10～20 L釀造實驗。新鮮釀酒葡萄除梗破碎，分3 次逐次添加亞硫酸，至游離硫含量達到45 mg/L，并添加20 mg/L果膠酶，混勻后，測定葡萄汁的總酸、總糖含量。采用新鮮調硫的葡萄汁進行菌株活化，將待測菌株以3%投料量加入到適量葡萄汁中，28℃恒溫培養箱中培養24h后，將活化好的待測菌株以106CFU/mL的接種量加入到發酵罐中，每個待測菌株設2 個平行。每日分早、中、晚3 次對發酵罐進行壓帽，并在壓帽后取樣監控發酵液的品溫和比重，比重到0.990～0.996時測定還原糖含量，還原糖含量小于2 g/L時結束發酵，酒精發酵結束后按GB/T 15038-2006檢測酒精體積分數、還原糖、總酸、揮發酸及干浸出物，其中總酸以酒石酸含量計，揮發酸以乙酸含量計。甘油檢測試劑盒測定甘油含量；由于大型發酵罐不能安裝H2S檢測管裝置，因此，酒樣中H2S的檢測參考GB/T 16489-1996《水質硫化物的測定》，采用亞甲基藍分光光度法。

1.2.4 感官品嘗

2010、2011年的小試酒樣由西北農林科技大學葡萄酒學院專業品嘗員組成品嘗小組從外觀、香氣、口感等方面對不同酒樣進行綜合感官評價。

2 結果與分析

2.1 高產甘油低產H2S優良酵母菌株篩選

表2 菌株發酵酒樣的理化指標Table 2 Physical and chemical indicators of wine fermented by the isolated strains

由表2可知，在供試野生酵母菌株的小白玫瑰葡萄汁發酵中，酒精體積分數為8.30%～12.06%；還原糖含量為1.80～47.50 g/L；揮發酸含量0.257～0.717 g/L低于GB 15037-2006《葡萄酒》規定的1.2 g/L，甘油含量為0.611～8.409 g/L。結合菌株發酵特性和高產甘油特性，將產生酒精體積分數大于10.00%、還原糖含量小于4.00 g/L、揮發酸含量低于0.60 g/L，甘油含量高于6.00 g/L（甘油的甜味閾值為5.2 g/L）的菌株判定為高產甘油的優良菌株，初步篩選出D06、D08、D10、D20、D21、E01、E02、E15、E18、E22、F12、F18、F23、F60、H02共15 株高產甘油的優良野生酵母菌株。

對上述篩選出的高產甘油酵母菌株進一步進行低產H2S特性的相關研究，在Triple M模擬葡萄汁的發酵中，各菌株H2S產量見表2。根據對照高產H2S菌株UCD819 的H2S產量為2.359 μg/mL，將H2S產量低于0.2 μg/mL的菌株定為低產H2S的優選菌株，最終篩選出E22、H02為高產甘油低產H2S的優選菌株。H2S含量分別為（0.195±0.117）μg/mL和（0.187±0.104）μg/mL；甘油含量分別為（6.769±0.042）g/L和（7.246±0.013）g/L。

2.2 優選菌株釀酒特性研究

2.2.1 發酵特性評價

優選菌株2010、2011連續2 a酒廠小試發酵實驗各項理化指標檢測結果見表3。發現H02、E22的釀酒特性穩定，酒樣的酒精體積分數≥11%，還原糖含量≤4.0 g/L，揮發酸含量≤1.2 g/L，符合GB 15037-2006中與釀酒微生物相關的各項指標要求，具有優良的發酵特性；其表現得到廠家的認可，前期的簡單觀察可初步確認優選菌的應用推廣潛力，后續分析尚待進行。

運用SPSS19.0數理分析統計軟件對優選菌和商業酵母原酒的各項理化指標在α=0.05顯著水平進行t檢驗，分析結果見表3。

酒精體積分數與H2S指標中，優選菌在2010、2011年赤霞珠和霞多麗中的表現與相應的對照商業酵母差異性都不顯著，查t檢驗臨界值表得：t（0.05,2）=4.303。由于優選菌2010、2011年酒精體積分數對應的各t值分別為－2.56、－1.79、2.33、－1.00、－2.39、1.41均小于t（0.05,2）= 4.303，及H2S對應的各t值分別為4.24、4.12、－0.45、2.12、－2.83、－1.90均小于t（0.05,2）=4.303，所以優選菌在2010、2011年赤霞珠和霞多麗中的表現與相應的對照商業酵母差異性都不顯著。

甘油和揮發酸指標，H02在2010年赤霞珠品種中的甘油和揮發酸含量與商業酵母RC212的差異性顯著（t=－4.88、－5.43，|t|≥t（0.05,2）=4.303），且甘油和揮發酸含量都明顯高于商業酵母RC212；優選菌在其他年份及品種中與各自相應的對照商業酵母均差異性不顯著（|t|＜t（0.05,2）=4.303）。

表3 葡萄原料及葡萄酒理化指標檢測結果Table 3 Physical and chemical indicators of grape and wine fermented by selected strains

還原糖和干浸出物指標，H02在2011年霞多麗品種中還原糖含量顯著高于VL1（t =－4.32）；H02在御馬產區2011年霞多麗和2010年赤霞珠中干浸出物含量分別顯著低于對應商業酵母VL1和RC212（t = 4.33、26.39）。

總酸指標中，H02在2010、2011年赤霞珠及2011年霞多麗中，總酸含量都分別顯著低于對應商業酵母RC212與VL1（t=15、6.43、5.66）。這可能是由于不同酵母在不同條件下有著不同的增酸或者降酸能力，導致最后酒樣中酸度差異較大。優選菌在其他各組中的總酸與相應商業酵母差異性不顯著（|t|＜t（0.05,2）=4.303）。綜合優選菌的各發酵指標與商業酵母比較分現，優選菌與商業酵母VL1、RC212、C2C有著相似的優良發酵特性。

2.2.2 感官特性評價

表4 葡萄酒感官品嘗結果Table 4 Sensory evaluation of wine fermented by selected strains

品嘗員對不同酒樣的感官評價平均得分見表4。運用SPSS19.0數理分析統計軟件對優選菌和商業酵母原酒品嘗員得分在0.05顯著水平進行t檢驗，查t檢驗臨界值表得：t（0.05,10）=2.228。分析比較發現，各優選菌與商業酵母酒樣之間感官特性均差異性不顯著（|t|＜t（0.05,10）= 2.228），且H02的2010赤霞珠、霞多麗與E22的2010赤霞珠與2011霞多麗的感官得分要分別高于對應商業酵母RC212、VL1和C2C。由此得出結論，優選菌株與商業酵母VL1、RC212、C2C在霞多麗、赤霞珠中的表現差異不顯著，感官品質相當，即具有類似于商業酵母的優良釀酒特性，具有發展成為商業酵母的潛在能力。

3 結 論

通過實驗室釀造實驗和菌株篩選，共獲得2 株高產甘油且低產H2S的葡萄酒優良野生酵母菌株，分別為H02、E22，在實驗室釀造實驗中其甘油與H2S含量分別為（7.246±0.013）、（6.769±0.042）g/L與（0.187±0.104）、（0.195±0.117）μg/mL，甘油含量均高于閾值5.2 g/L，H2S含量均低于0.2 μg/mL。

在2010、2011年寧夏御馬酒廠、山西戎子及甘肅莫高酒廠的小試發酵實驗中，通過t檢驗分析結果發現，優選菌株與商業酵母VL1、RC212、C2C有著相似的優良發酵特性，且發酵酒樣都符合中華人民共和國國家標準：GB 15037-2006規定的要求，優選菌具有甘油產量高、H2S產量低的特點且發酵特性良好，其表現得到廠家的認可。酒樣綜合感官評價的t檢驗分析結果顯示，優選菌的感官評價結果和各自對應商業酵母VL1、RC212、C2C差異均不顯著，感官品質相當，具有發展成為商業酵母的潛在能力。

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Screening and Evaluation of Yeast Strains for Producing Wine Higher in Glycerol and Lower in Hydrogen Sulphide

GONG Xue1, JIANG Lu1, LIU Ning1, LIU Yanlin1,2,*
(1. College of Enology, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Engineering Research Center for Wine and Viticulture, Yangling 712100, China)

In order to screen excellent yeast strains for improving the sensory quality of wine, 40 wild yeast strains were isolated from naturally fermented grapes grown in Xinjiang and Ningxia autonomous regions for laboratory-scale wine fermentation. H02 and E22 strains were screened as excellent strains for producing high-glycerol, low-hydrogen sulphide wine. Fermentation experiments for laboratory-scale production of wine (10 - 20 L) were conducted using the two strains in 2010 and 2011, respectively, for investigating their fermentation characteristics. The physical and chemical indexes of the resulting wines met the requirements of the Chinese national standard GB 15037-2006 for wine. In terms of sensory evaluation, there was no signifi cant difference (P ＞ 0.05) between the two strains and commercial yeasts VL1, RC212 and C2C. These results indicate that the screened strains have excellent fermentation characteristics for wine production.

glycerol; grape wine; yeast; screen; wine-brewing

TS261.1

A

1002-6630（2015）19-0132-05

10.7506/spkx1002-6630-201519023

2013-11-10

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD31B07）；國家現代農業（葡萄）產業技術體系建設專項（CARS-30-jg-3）

宮雪（1988-），女，碩士研究生，研究方向為葡萄酒分析檢測及釀酒微生物。E-mail：gongxue@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：劉延琳（1966-），女，教授，博士，研究方向為葡萄-葡萄酒及釀酒微生物。E-mail：yanlinliu@nwsuaf.edu.cn