不同體積分數乙醇沉淀桑黃胞內多糖的理化性質及抗氧化活性

周慧吉，馬海樂，郭丹釗，王振斌

（江蘇大學 江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇 鎮江 212013）

不同體積分數乙醇沉淀桑黃胞內多糖的理化性質及抗氧化活性

周慧吉，馬海樂*，郭丹釗，王振斌

（江蘇大學 江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇 鎮江 212013）

研究桑黃胞內多糖醇沉過程中乙醇體積分數對多糖得率、純度、理化性質和抗氧化活性等的影響。結果表明：隨著乙醇體積分數的增加，沉淀粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現不規則的變化；不同體積分數乙醇沉淀獲得的桑黃多糖中均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。掃描電鏡圖像顯示，低體積分數（65%、75%、85%）乙醇沉淀的多糖呈現均勻球狀，高體積分數（95%)乙醇沉淀的多糖連成大塊片狀。桑黃胞內多糖體外抗氧化能力存在明顯的量-效關系，95%乙醇沉淀的多糖對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、2,2’-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）自由基的清除效果最好，對Fe3+的還原能力最強，抗氧化活性最高。

桑黃；胞內多糖；理化性質；體外抗氧化活性

桑黃是我國的一種傳統藥物，通常生長在桑屬植物上，因其子實體顏色鮮黃而俗稱為桑黃。桑黃的主要活性成分是桑黃多糖和黃酮類化合物[1-2]。有關研究證明，桑黃多糖具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、免疫調節、抗肝硬化和保肝等活性功能[3-4]。由于桑黃自然生長緩慢，液體發酵成為了工業化高效制備桑黃多糖的重要途徑[5-6]。醇沉是從發酵提取液中分離多糖的主要方法，乙醇體積分數直接影響著所獲得多糖的結構及其性質。本研究在前期優化桑黃菌絲體液體發酵及其胞內多糖提取技術的基礎上，重點針對利用乙醇沉淀獲取提取液粗多糖的過程中，乙醇體積分數對多糖得率、純度、理化性質和抗氧化活性等的影響開展研究，旨在為桑黃多糖的高效制備和科學利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

桑黃菌株（菌株編號為5.95），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

氯仿、正丁醇、鹽酸羥胺、吡啶、鹽酸、苯酚、水楊酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、醋酸鈉均為國產分析純。

培養基由小麥粉51.6 g、米糠13.8 g、磷酸二氫鉀0.9 g、硫酸鎂0.54 g組成，加自來水配制至1 000 mL。

1.2 儀器與設備

CARY紫外掃描分光光度計 美國瓦里安公司；YC-211恒溫培養搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；HP6890N氣相色譜儀、DEC-A2型表面處理儀、HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 搖瓶液體發酵

在250 mL三角瓶中裝100 mL配制好的發酵培養基，按體積分數10%的量接種桑黃菌種，發酵溫度為27.5 ℃，搖床轉速為125 r/min，發酵時間為7 d，發酵結束后過濾菌絲，冷凍干燥后備用[7]。

1.3.2 桑黃粗多糖的提取與醇沉實驗

將干燥的桑黃菌絲體碾磨粉碎。加入10 倍體積分數為70%的乙醇，靜置12 h，5 000 r/min離心10 min去除上清液，旨在脫除黃酮類物質。離心殘渣中按照1∶30 （m/V）的料液比加入水，于100 ℃水浴鍋中水煮2 h，以同樣的料液比水煮3 次。10 000 r/min離心15 min后收集上清液[8-9]，旋轉蒸發濃縮至原來體積的1/4。分別加入4 倍體積分數為65%、75%、85%、95%的乙醇，過夜。10 000 r/min離心10 min取沉淀，真空冷凍后即得到桑黃粗多糖[10]。研究不同體積分數醇沉多糖的組成及其特性。

1.3.3 桑黃多糖的檢測分析

按照上述提取條件對Sevag法[11]除蛋白后得到的粗多糖的多糖含量、單糖組成、紅外光譜、體外抗氧化活性、電鏡掃描進行測試分析。

1.3.3.1 多糖含量測定

參照文獻[12-13]的方法進行標準曲線的繪制和桑黃多糖含量的測定，通過式（1）、（2）計算粗多糖得率及多糖含量。

1.3.3.2 單糖組成分析

采用糖精乙酸酯作為衍生物，氣相色譜法測定桑黃多糖的單糖組成[12]。

1.3.3.3 黃酮含量測定

用電子天平精確稱取蘆丁標準品5 mg，于25 mL容量瓶中，并用70%乙醇溶解定容，配制成0.2 mg/mL的標準溶液。取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，依次加入質量分數5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻靜置6 min。加入質量分數10%硝酸鋁1 mL，搖勻靜置6 min；再加入質量分數4.3%氫氧化鈉10 mL，最后加蒸餾水定容，搖勻靜置15 min。空白參照液直接加入6 mL蒸餾水，后面依次加入相同的試劑。用紫外分光光度計在510 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。準確稱取各粗多糖樣品0.5 g加6 mL蒸餾水，按上述方法測定吸光度，計算黃酮含量。

1.3.3.4 紅外光譜掃描[13]

取樣品l mg，溴化鉀壓片，測定范圍4 000～400 cm－1。

1.3.3.5 體外抗氧化活性測定

采用文獻[14]的方法進行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定；采用文獻[15]的方法進行羥自由基（·OH）清除能力的測定；參照Rice-Evans等[16]所報道的方法進行水溶性VE（trolox）等價抗氧化能力（trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC）測定；采用文獻[17]的方法進行鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant potential assay，FRAP）的測定。

1.3.3.6 掃描電鏡觀察

將凍干的多糖樣品直接壓在涂過導電銀膠的樣品臺上，用DEC-A2型表面處理儀噴鍍金原子，采用HITACHI S-570型掃描電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 桑黃粗多糖中多糖含量

表1 乙醇體積分數對桑黃粗多糖中多糖含量的影響Table 1 Effect of alcohol concentration on crude polysaccharide yield and protein content

不同體積分數乙醇沉淀桑黃粗多糖得率及其多糖含量如表1所示，隨著乙醇體積分數的增加，沉淀粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現不規則的變化，其主要原因可能在于當乙醇體積分數達到一定值之后，乙醇體積分數的變化更多的是影響到沉淀中粗多糖的結構，因為低體積分數乙醇沉淀下來的主要是高分子質量的多糖、高體積分數乙醇沉淀下來的則是較小分子質量的多糖和低聚糖。分子質量越小，分子中的自由氨基越多，可能致使其活性增強[18-19]。當然多糖的生物活性不僅與分子質量大小有關，還與其立體結構、糖單元的組成、糖苷鍵的類型、取代基的種類及數量等都有密切關聯[20-21]。后續將研究不同體積分數乙醇沉淀所得多糖的結構與抗氧化活性的變化。各粗多糖樣品在510 nm波長處的吸光度均基本為0.0，說明粗多糖中不存在或存在非常少的黃酮類物質。

2.2 桑黃粗多糖中單糖組成分析

采用鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖6 種標準單糖樣品作為參照，進行桑黃粗多糖的單糖組成分析。標準單糖的氣相色譜圖如圖1所示，不同體積分數醇沉多糖的氣相色譜圖如圖2所示，其定量分析結果見表2。

圖1 單糖標準品的氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of mixed monosaccharide standards

圖2 不同體積分數乙醇沉淀樣品的氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of samples precipitated by different alcohol concentrations

表2 乙醇體積分數對單糖組分的影響Table 2 Effect of alcohol concentration on monosaccharide composition of crude polysaccharides

由表2和圖2可知，不同體積分數乙醇沉淀的多糖樣品單糖組成相似，均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，但單糖組成比例有一定的差異。此外，4 種樣品均包含1 種未知單糖成分，其出峰時間大約在6.5 min左右，該單糖峰在4 種樣品中的含量也略有差異。

2.3 桑黃多糖的紅外光譜分析

用來檢測化合物結構的紅外光譜通常指波數在4 000～400 cm－1之間的中紅外光譜。其具有高度的特征性，能夠測定分子內部原子間的相對振動和分子轉動等信息，是研究聚合物結構和化學鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一。由于多糖的結構具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰[22]。在紅外光譜中，3 400 cm－1附近是O-H和N-H鍵較強的伸縮振動吸收峰，在2 920 cm－1附近的吸收峰是-CH2或-CH3中C-H鍵的伸縮振動引起的，在1 600 cm－1附近的吸收峰可能是COO-中的C=O鍵的不對稱伸縮振動引起的或是N-H變角振動引起的，1 400 cm－1附近的吸收峰可能是由-COOH中的C-O鍵伸縮振動或是C-H鍵的反對稱伸縮振動和變角振動引起的；1 000 cm－1附近的吸收峰是由C-O-H和吡喃糖環的C-O-C中的兩種C-O鍵的伸縮振動引起的。

圖3 不同體積分數乙醇提取桑黃多糖的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectra of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

由圖3可知，所有的多糖均在3 420、2 900、1 400、1 100 cm－1這4 個區域出現糖類物質的典型特征吸收峰，而且在1 000～800 cm－1間有許多弱小吸收峰，說明可能含有β-D-吡喃葡萄糖環，可能以β-糖苷鍵連接。可以看出，不同體積分數乙醇沉淀的多糖在結構上并無明顯不同。

2.4 桑黃多糖的形態

圖4 桑黃多糖的掃描電鏡圖Fig.4 SEM ima ges of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

圖4是不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的掃描電鏡圖。可以看出65%、75%、85%乙醇沉淀的多糖呈球狀，比較均勻。95%乙醇沉淀的多糖會有大塊片狀出現。隨著乙醇體積分數的升高，桑黃多糖粒徑增大，緊密度減小，變得松散，當乙醇體積分數達到95%時，桑黃多糖已經連成片狀。

2.5 桑黃多糖的體外抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除效果

圖5 不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的DPPH自由基清除率Fig.5 DPPH radical scavenging rates of Phellinus igniarius polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

由圖5可知，低體積分數乙醇提取的桑黃多糖，隨著多糖質量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率升高，且量-效關系明顯，但是桑黃多糖質量濃度較高時，其DPPH自由基清除率略微下降，有可能是乙醇將多糖析出，從而了影響體系吸光度。桑黃多糖質量濃度為2 mg/mL時，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的多糖對DPPH自由基的清除率分別為（33.85±2.00）%、（29.61±0.05）%、（40.40±0.15）%和（40.57±1.35）%。95%乙醇提取的桑黃多糖對DPPH自由基清除率最高，是75%體積分數乙醇的1.31 倍。

2.5.2 ·OH清除效果

圖6 不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的·OH清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging rates of Phellinus igniarius polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

圖6是不同體積分數乙醇沉淀的多糖對·OH清除率的影響。隨著多糖質量濃度的增加，其對反應體系產生的·OH的清除率增大，量-效關系非常明顯。在相同質量濃度下，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖清除·OH的IC50分別為3.19、3.60、3.86、3.18 mg/mL。IC50越小，說明所需的多糖質量濃度越低，其抗氧化性越好。以上實驗數據均表明，不同體積分數乙醇制取的桑黃多糖對·OH清除效果只有略微差別。

2.5.3 TEAC值

以水溶性VE為參照物，測得不同質量濃度水溶性VE與TEAC值的校準曲線方程為y=0.891 7x+0.028 3 （R2=0.998 8）。圖7是不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的TEAC值，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖的TEAC值分別為（0.149±0.006）、（0.122±0.004）、（0.141±0.006）、（0.176±0.005） μmol/mg。

圖7 不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的TEAC值Fig.7 TEAC values of polysaccharide precipitated by different ethanol concentrations

2.5.4 FRAP值

以FeSO4為參照物，測得不同質量濃度FeSO4與FRAP值的校準曲線方程為y=0.018 1x－0.017 5（R2= 0.994 1）。圖8是不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的FRAP值，65%、75%、85%、95%乙醇沉淀的桑黃多糖得到的FRAP值分別為（9.59±0.20）、（8.56±0.04）、（10.58±0.32）、（10.66±0.45）mmol/L。

圖8 不同體積分數乙醇沉淀桑黃多糖的FRAP值Fig.8 FRAP values of polysaccharides precipitated by different ethanol concentrations

3 結 論

本實驗初步研究了不同體積分數乙醇對桑黃胞內多糖的提取、理化性質和單糖組成的影響，并以此為基礎探討桑黃胞內多糖的體外抗氧能力，為深入研究桑黃多糖的化學結構和生物活性的構效關系提供參考。

不同體積分數乙醇沉淀可能會影響桑黃多糖的分子質量、糖單元組成、立體結構，從而改變多糖的生物活性。隨著乙醇體積分數的增加，粗多糖的得率增加，而粗多糖中多糖含量呈現不規則的變化；不同體積分數乙醇沉淀獲得的桑黃多糖中均含有木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖，但是各種多糖間比例存在差異，并且4 種樣品中均檢測出一種未知成分。紅外光譜掃描結果顯示65%、75%、85%、95%乙醇沉淀獲得的樣品均在3 420、 2 900、1 400、1 100 cm－1區域內出現糖類物質的典型特征吸收峰，并且都含有β-D-吡喃葡萄糖環，在結構上類似；而單糖成分及結構的差異性也會引起桑黃多糖生物活性的差異性[23-24]。

掃描電鏡圖像顯示，低體積分數乙醇沉淀的多糖呈現均勻球狀，高體積分數乙醇沉淀的多糖連成大塊片狀。隨著乙醇體積分數的升高，桑黃多糖粒徑增大，緊密度減小，松散度增加；桑黃胞內多糖體外抗氧化能力存在明顯的量-效關系，95%乙醇沉淀的桑黃多糖抗氧化活性最高，其對DPPH自由基清除率為40.57%、清除·OH的IC50為3.18 mg/mL、TEAC值為0.176 μmol/mg、FRAP值為10.66 mmol/L。

[1] 莫順燕, 楊永春, 石建功. 桑黃化學成分研究[J]. 中國中藥雜志, 2003, 28(4): 339-341.

[2] 周存山, 馬海樂. 桑黃及其藥理作用研究進展[J]. 食用菌, 2005, 27(2): 50-51.

[3] IM S A, KIM K, LEE C K. Immunomodulatory activity of polysaccharide isolated from Salicornia herbacea[J]. International Immunopharmacology, 2006, 6(9): 1451-1458.

[4] YANG Tiehong, JIA Min, MENG Jia, et al. Immunomodulatory activity of polysaccharide isolated from Angelica sinensis[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2006, 39(4): 179-184.

[5] 馬海樂, 閆景坤, 祝子坪, 等. 桑黃菌誘變菌株液體發酵試驗[J]. 江蘇大學學報: 自然科學版, 2012, 33(1): 6-10.

[6] 謝麗源, 張勇, 彭衛紅, 等. 桑黃胞內多糖免疫及抗氧化活性研究[J].食品科學, 2011, 32(9): 276-281.

[7] 胡文彬, 馬海樂, 周存山. 桑黃菌液體發酵培養基及發酵條件研究[J].中國食用菌, 2006, 25(3): 49-52.

[8] 車會蓮. 桑黃提取物抑制腫瘤作用及其機制研究[D]. 哈爾濱: 哈爾濱醫科大學, 2005: 42-43.

[9] 溫克, 陳勁, 李紅, 等. 桑黃等四種抗癌藥物抗癌活性比較[J]. 吉林大學學報: 醫學版, 2002, 28(3): 247-249.

[10] 郭樹凡, 張慧麗, 李昱, 等. 桑黃子實體多糖提取條件的研究[J]. 食用菌學報, 2007, 13(4): 49-55.

[11] 冀頤之, 杜連祥. 深層培養裂褶菌胞外多糖的提取及結構研究田[J].微生物學通報, 2003, 30(5): 15-20.

[12] 張培敏, 朱巖, 凌艷艷. 離子色譜脈沖安培檢測法測定水體顆粒物與河口沉積物中的糖[J]. 浙江大學學報: 理學版, 2004, 31(4): 431-434.

[13] ZHAO Liyan, DONG Yanhong. Extraction, purification, characterization and antitumor activity of polysaccharides from Ganoderma lucidum[J]. Carbohydrate Polymers, 2010, 80(3): 783-789.

[14] OKADA Y, OKADA M. Scavenging effect of water soluble proteins in broad beans on free radicals and active oxygen species[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1998, 46(2): 401-406.

[15] SMIRNOFF N, CUMBES Q J. Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry, 1989, 28(4): 1057-1060.

[16] RICE-EVANS C A, MILLER N J, PAGANGA G. Structureantioxidant activity relationships of fl avonoids and phenolic acids[J]. Free Radical Biology and Medicine, 1996, 20(7): 933-956.

[17] LEUNG P H, ZHAO Shuna, HO K P, et al. Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-HK1[J]. Food Chemistry, 2009, 114(4): 1251-1256.

[18] 楊典洱, 林曉怡, 向本瓊, 等. 脫乙酰殼多糖抑制真菌生長的構效關系[J]. 化學學報, 2005, 63(18): 1661-1665.

[19] WASSER S P. Medicinal mushrooms as a source of antitumor and immunomodulating polysaccharides[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 60(3): 258-274.

[20] 封聚強, 趙駿. 中藥多糖的分子量及結構研究進展[J]. 時珍國醫國藥, 2008, 19(3): 624-625.

[21] CLEARY J A, KELLY G E. The effect of molecular weight and β-1,6-linkages on priming of macrophage function in mice by (l,3)-β-D-glucan[J]. Immunology & Cell Biology, 1999, 77: 395-403.

[22] GNANASAMBANDAM R, PROCTOR A. Determination of pectin degree of esterification by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectroscopy[J]. Food Chemistry, 2000, 68(3): 327-332.

[23] 侯安繼, 陳騰云, 彭施萍, 等. 茯苓多糖抗衰老作用研究[J]. 中藥藥理與臨床, 2004, 20(3): 10-11.

[24] 馮慧琴, 楊慶堯, 楊曉彤, 等. 灰樹花子實體多糖和菌絲體多糖的比較分析[J]. 華東師范大學學報: 自然科學版, 2001(3): 91-96.

Physicochemical Properties and Antioxidant Activity of Intracellular Polysaccharides from Phellinus igniarius Precipitated by Different Ethanol Concentrations

ZHOU Huiji, MA Haile*, GUO Danzhao, WANG Zhenbin
(Key Laboratory of Physical Processing of Agricultural Products in Jiangsu Province, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

In this study, the effect of ethanol concentration on the yield, purity, physicochemical properties and antioxidant activity of intracellular polysaccharides (IPs) isolated from Phellinus igniarius was analyzed. Results indicated that with an increase in ethanol concentration, the yield of crude polysaccharides increased, but polysaccharide content of the precipitated crude polysaccharides changed irregularly. Each of the IPs precipitated by different concentrations of ethanol contained xylose, mannose, galactose and glucose. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IPs precipitated by low concentration (65%、75%、85%) of ethanol presented a uniform spherical shape, whereas those precipitated by high concentration (95%) of ethanol were clustered into large fl akes. IPs of Phellinus igniarius had obvious antioxidant activity in vitro in a dose-dependent manner and the IPs precipita ted by 95% ethanol had the best scavenging activity against DPPH, hydroxyl and ABTS+free radicals and the strongest ferric reducing antioxidant power.

Phellinus ign iarius; intracellular polysaccharides (IPs); physicochemical properties; antioxidant activity in vitro

TS205.9

A

1002-6630（2015）19-0034-05

10.7506/spkx1002-6630-201519006

2014-11-19

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD36B05）；國家自然科學基金青年 科學基金項目（31301544）；鎮江市科技支撐計劃工業項目（GY20130018）

周慧吉（1990-），女，碩士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：zhouhuiji0523@163.com

*通信作者：馬海樂（1963-），男，教授，博士，研究方向為農產品加工及貯藏。E-mail：mhl@ujs.edu.cn