基于微小發光真菌的化妝品化學毒性測試方法

陳蘭（海南師范大學 ?？?570100）

隨著人民生活水平的提升，對于化妝品的利用率越來越高，這就為化妝品的質量提出了很高的要求，但是現如今在市場中流通的化妝品種類紛繁多樣，品質也各不相同，一些化妝品中甚至還有許多對人類身體有毒有害的化學成分。這些有毒物質本身具有很強的潛伏期，在經過使用后會存在于人體內進行富集，所以非常不易發現，隨著近些年來一些因濫用化妝品導致疾病的事件不斷發生，人們開始關注這些有毒物質的檢測，但是傳統的檢測方法往往針對具有某一特點的有毒有害物質，現在已經不能適應不斷變異的有毒物質檢測工作，經過研究，一種新的檢測方法——發光真菌檢測法被提出來，并具有很好的效果，本文就針對這種化妝品中有毒物質檢測方法進行如下的論述。

1 實驗儀器和藥劑

進行該檢測實驗所應用到的化學藥劑主要有硫酸鐵、亞硫酸鐵、氯金酸、檸檬酸三鈉、濃度為30%的氨水、魯米諾、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris堿、APTES、高純度的氮氣、氯化鈉、對碘苯酚。應用到的儀器為分光光度計（可見光、紫外線光）、生化培養箱、恒溫振蕩器、發光檢測儀、酶標儀、振動磁強計。

2 實驗過程

2.1 四氧化三鐵微粒的制備

在制備四氧化三鐵微粒時，本實驗采用的是化學沉淀法，將硫酸鐵溶液和亞硫酸鐵溶液按照一定的比例進行混合，然后將堿性的沉淀劑加入混合液中，經過不斷的攪拌之后放置，一段時間以后就會得到納米級的四氧化三鐵微粒，具有一定的磁性。

反應的方程式為：

之后再取10mL的微粒按照水和乙醇1比1的比例配制90mL的混合溶液放入到容量為250mL的圓底燒瓶中，進行搖勻，之后再向其中加入300微升的硅烷化試劑盒500微升的氨水，在60攝氏度的條件下向其中通入氮氣，以每分鐘500轉的速度進行攪拌，時間為6小時。之后將其中的微粒取出，用無水乙醇和蒸餾水進行反復地沖洗，直到沖洗出的液體中沒有黃色，之后用無水乙醇進行定容，測出其中固體物質的含量。

2.2 合成膠體金

進行膠體金的合成主要是通過氯金酸在白磷、枸櫞酸鈉、抗壞血酸、鞣酸等物質的還原作用下所析出的一種納米級別的金顆粒。具體的制備方法為：取濃度為0.01%的氯金酸溶液200mL放入四頸瓶中，之后以每分鐘500轉的速度于90攝氏度的條件下進行預熱攪拌，時間大約為5分鐘，之后向其中加入濃度為1%的檸檬酸三鈉適量水溶液直到溶液的顏色不發生變化，之后通過冷卻回流就能夠制備得到粒徑在20納米左右的膠體金，這種物質的外觀是橙紅色的，需要放在棕色瓶中保存。

2.3 制備TP混合抗原

取0.4mL配制好的合成膠體金，撇清其上清液，用0.5mL偶聯緩沖液對其進行清洗以調節pH值的平衡，通過磁性分離撇清其上清液。在磁粒中投加0.5ug/ul的抗原溶液，放于搖床中以每分鐘200轉的速度攪拌反應30分鐘。通過磁性分離，向磁粒中加入封閉液，放入恒溫振蕩器中以每分鐘200轉的速度進行攪拌，對磁粒進行封閉，通過磁性分離，撇清其上清液，之后用PBST進行3次清洗，將磁粒放于1mLPBS中保存，通過顛倒混合后保存備用。

2.4 發光檢測體系的形成

在每個反應管中個加入30微升的TP混合抗原、HRP標記好的抗原和50pL陽性血清和陰性血清，放入恒溫振蕩器進行震蕩30分鐘，溫度為37攝氏度，之后取出進行磁性分離，撇清其上清液，用PBST進行反復沖洗，之后再次進行磁性分離，撇清其上清液，向其中加入PBS10微升，最后將樣品移到化學發光專用的孔板中，分別加入20微升過氧化氫、PIP、Luminol和0.05%的Tween-20，分別放入到發光檢測儀進行檢測。

3 實驗的結果和分析

3.1 磁微粒的表征

首先需要合成磁微粒，這需要經過兩道步驟：首先，需要合成膠體金微粒和四氧化三鐵微粒，具體的方法已經在上文中提到，這里不再進行贅述，用有機硅烷這種試劑對四氧化三鐵微粒進行修飾，使微粒的表面附著上-SH這一基團；其次，將膠體金微粒和四氧化三鐵微粒進行混合反應可以得到平均粒徑為3微米左右的磁微粒。磁微粒在制備過程中會存在四種變化狀態，具體見圖1。

圖1 磁微粒在制備過程中的變化圖

其中，圖中的A反應狀態為四氧化三鐵的化學微粒，這是通過化學沉淀法制得的；圖中的B反應狀態為用有機硅烷這種試劑對四氧化三鐵微粒進行修飾后的狀態；圖中的C反應狀態為混合反應后生成的磁微粒膠體；圖中的D反應狀態為經過沉淀借助于組裝法得到的磁微粒。

由于膠體金于520nm處的可見光區具有吸收峰，因此把粒徑為20納米左右的膠體金加入到磁微粒中進行反應，通過紫外光的分光光度計分別對膠體金與反應合成后的磁微粒分別進行吸光度的檢測，檢測結果見圖2。

圖2 膠體金和合成磁微粒的吸光度

從圖上可以看出，隨著反應時間的提升，520納米處的吸光度越來越小，膠體金也越來越小，其納米粒子都被吸附到了合成磁微粒的表面。此外，在不同的波段、波長處，每個樣本吸光度都是不同的，以此來進行區分。通過對比圖上給出曲線的共同點可知，吸光度本身的響應曲線非常平坦，只有在特定波長范圍才會出現峰值，這樣就能夠加以利用實現光學的檢測。

借助于振動磁強計對合成的磁微粒和四氧化三鐵微粒分別進行測量，可以得到圖3中的磁滯曲線。

圖3 磁滯曲線圖

從圖中可以看出，合成的磁微粒具備很強的超順磁性。

3.2 磁微粒表面發光體系性能和固定化的分析

磁微粒的表面有大量的膠體金，蛋白分子能夠借助于疏水作用、和磁粒之間的靜電作用以及半胱氨酸的殘基側鏈所具備的巰基作用將抗原分子固定在磁微粒的表面。使用紫外線分光光度計對包被之前的TP抗原和反應后的溶液進行吸光度的測定，可以發現，280納米處TP抗原有著明顯的吸收峰，而反應后的溶液在這點之后幾乎沒再出現吸收峰，這就說明抗原幾乎全部都被包在磁微粒的表面。

4 結語

以上就是基于放光真菌這種測試方法的整個流程，這種方法先將化妝品種的有毒物質轉化成為一種穩定檢測物，因此具有很強的可靠性和準確性，同時這種方法也比較簡單，因此適用于化妝品安全檢測這一工作。

[1]張華榮,董國富,雷紅宇,等.5種化妝品毒性檢測方法的應用評估[J].中國國境衛生檢疫雜志，2007,10(04).

[2]郭文秀,孫志,云華,等.化妝品毒性檢測方法新進展[J].中國國境衛生檢疫雜志,2012,35(06).