牛DKK2基因pcDNA3.1表達載體的構建

陶虎　熊琪　李曉峰　索效軍　張年　楊前平　劉洋　陳明新

摘要：DKK2基因是Wnt信號通路的關鍵抑制因子，在胚胎發育、顆粒細胞生成等過程中發揮重要作用。擴增了牛DKK2基因CDS序列，構建了DKK2基因pcDNA3.1真核表達載體；為進一步驗證載體在細胞內的表達效果，將表達質粒瞬時轉染CHO細胞，利用qRT-PCR和Western blot檢測DKK2的表達情況。結果表明，在CHO細胞中轉染DKK2基因的真核表達載體質粒，其mRNA和蛋白質表達量均顯著上升，表明已成功構建了DKK2基因表達載體，為下一步開展DKK2基因功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：牛；DKK2基因；pcDNA3.1表達載體；細胞轉染；基因超表達

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5751-03

Abstract：DKK2 gene is the key inhibitory factor of the Wnt signaling pathways， and plays an important role in the process of embryonic development， granular cell generation and so on. This study amplified the CDS sequence of cow DKK2 gene and built its pcDNA3.1 eukaryotic，then verified the correctness by enzyme digestion and sequencing. In order to further verified the expressing effect of this expression vector in cells， the vector was transfected into CHO cells transiently， then DKK2 expression was detected by using qRT-PCR and Western blot. The results showed that the mRNA and protein expressions of DKK2 gene were significantly increased in CHO cells， and indicated the pcDNA3.1 of DKK2 gene had been successfully constructed. This laid the foundation of the next step of DKK2 gene function research.

Key words： cow； DKK2 gene； pcDNA3.1 expression vector； infected cells； gene overexpression

哺乳動物卵泡的發育過程非常復雜，并且與家畜的繁殖性能緊密關聯。利用超聲掃描等手段，對家畜卵泡的發育模式進行了較為深入的研究，但對卵泡發育的調控機理仍需進一步的研究。對調控規律的研究有助于分析家畜繁殖性能的分子機制，對于生產具有重要的指導意義。

DKK蛋白家族包含DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，均為分泌性糖蛋白[1]。DKK蛋白通過結合LRP5/6，抑制Wnt信號通路來發揮調控作用[2，3]。DKK2基因與胚胎著床及子宮內膜蛻膜化過程密切相關[4，5]。DKK2基因敲除的小鼠能正常生育，但個體小于同窩的其他小鼠[6，7]。此外，DKK2基因可調控上皮細胞和間質細胞的轉化，可作為蛻膜的標記物[8]。由此可見，DKK2基因在雌性哺乳動物繁殖過程中發揮重要調控作用，但尚未見到該基因調控卵泡發育分子機制的相關報道。本研究采用基因工程技術，構建了牛DKK2基因pcDNA3.1表達載體，為開展DKK2基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣本取自牛肌肉組織；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和pcDNA3.1表達載體由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存；質粒pMD18-T Vector購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內切酶Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶及高保真DNA聚合酶購自NEB公司；DKK2抗體購自Abcam公司；凝膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒均購自Omega公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DKK2基因CDS序列的擴增 根據GenBank中DKK2基因cDNA已知序列，設計合成引物，并在引物5端和3端分別引入了NheⅠ和Hind Ⅲ的酶切位點。正向引物為5-CTAGCTAGCGCCACCATGGCCGTGTTGATGCGG-3，反向引物為5-CCCAAGCTTTCATATTTTCTGGCATACATGGA-3，以DKK2基因cDNA為模板。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預期擴增片斷大小為780 bp。PCR擴增反應程序：94 ℃預變性4 min； 94 ℃變性30 s + 62 ℃變性30 s + 72 ℃變性1 min，35個循環；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。所用酶為Taq Plus DNA Polymerase。PCR儀為Mini CyclerTM基因擴增儀。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA快速純化回收試劑盒回收目的片段，具體操作按產品說明書進行。

1.2.2 克隆載體的構建 所用載體為pMD18-T Vector，可進行酶切鑒定和測序。連接反應體系為：8 μL純化后的PCR產物、1 μL 10×Ligation Buffer、 1 μL pMD18-T Vector，于16 ℃金屬浴條件下連接4 h。取10 μL連接產物，加入50 mL DH5α感受態細胞，輕輕吸打混勻，冰浴5 min，42 ℃熱擊45 s。將混合體系用無菌涂布棒均勻涂布于含Amp（氨芐）的LB固體培養基上，將培養皿倒置于37 ℃培養箱中過夜。

1.2.3 表達載體的構建與鑒定 在培養皿上隨機挑取10個單菌落，分別接種于1.5 mL LB液體培養基中，于37 ℃，200 r/min條件下振蕩培養4 h。挑選陽性克隆提取質粒，和pcDNA3.1質粒一并進行NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切。利用凝膠回收試劑盒回收酶切產物，16 ℃條件下連接4 h后轉化至DH5α感受態細胞中，利用含有Amp的LB培養基篩選陽性克隆。以菌液為模板，利用通用引物經PCR擴增檢測目的片段大小，將陽性菌液送至北京奧科生物科技公司測序，測序正確的克隆提取質粒備用。

1.2.4 細胞培養及DKK2表達質粒轉染 CHO（中國倉鼠卵巢細胞系）細胞系由湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所保存，細胞培養基為DMEM-F12中加入10%的胎牛血清，培養箱條件為5% CO2、37 ℃。待細胞培養至80%的融合度，使用胰酶消化后均勻接種于6孔板中。每孔加入100 μL的lipofectmin 2 000和DKK2表達質粒的復合物于細胞培養箱中培養，24 h后提取RNA，48 h提取總蛋白，均-80 ℃保存備用。

1.2.5 DKK2基因表達分析 將RNA反轉錄為cDNA，并設計定量引物DL-PF：5ATCTGCGGGCACATACCA3，DL-PR：5CTCCCAACTTCACATTCCT TA3；采用qRT-PCR檢測超表達DKK2基因的CHO細胞中該基因表達量。將總蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完畢后將蛋白質轉印至硝酸纖維膜上50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，DKK2抗體4 ℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，洗膜后經ECL試劑盒曝光顯影。

2 結果與分析

2.1 牛DKK2基因編碼區擴增

取牛肌肉組織提取總RNA后，反轉錄成cDNA作為模板，通過PCR擴增DKK2基因的CDS序列。經凝膠電泳結果顯示，片段長度與預期結果相符（DKK2的CDS長度為780 bp），并未出現非特異性條帶（圖1）。

2.2 DKK2基因表達載體的構建

DKK2基因CDS序列的PCR產物和pcDNA3.1載體經NheⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后，切膠回收。利用T4連接酶，連接載體和CDS序列的雙酶切產物，并克隆轉化入DH5α，培養過夜后挑選陽性克隆進行鑒定。

2.2.1 雙酶切鑒定 陽性克隆質粒采用NheⅠ和Hind Ⅲ進行雙酶切，酶切后分別釋放出相應大小的特異性條帶（圖2），結果與預期相符。

2.2.2 測序鑒定 將陽性菌液送公司測序，所得結果通過序列比對軟件BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiCMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome）

進行比對分析，結果表明，目的片段與NCBI數據庫中提交的片段序列完全一致（圖3）。

2.3 qRT-PCR和Western blot檢測重組質粒表達

將表達載體pc-DKK2瞬時轉染CHO細胞，轉染后24 h提取RNA，48 h后提取總蛋白質，分別利用qRT-PCR和Western blot檢測重組質粒表達情況。結果表明，過表達DKK2基因后，CHO細胞中DKK2基因的mRNA表達量升高了17 782倍，效果極顯著（P<0.001），在蛋白質水平較之于pcDNA3.1空載體組顯著升高（P<0.05），說明表達載體構建成功，可用于后續試驗。

3 小結與討論

本研究通過擴增牛DKK2基因的CDS全長序列，通過雙酶切并回收目的序列，利用基因工程技術構建了DKK2基因的pcDNA3.1表達載體；然后利用雙酶切凝膠電泳和測序技術驗證擴增序列的正確性；最終在CHO細胞中進行了質粒的表達驗證，所得到的質粒可用于后續DKK2基因功能的試驗研究。

綜合前人研究，卵泡顆粒細胞可分泌性腺激素，具有支持卵泡的作用，能夠維持卵巢正常功能[9，10]。圍繞卵丘的顆粒細胞構建了細胞調控網絡，與卵泡進行物質和信號交換，其中雌激素的分泌最為重要[11]。由此可見，顆粒細胞在卵泡發育過程中發揮著重要作用。Wnt信號通路極為保守，在哺乳動物生長發育、疾病、衰老等過程中發揮重要作用[12，13]。Wnt信號通路在顆粒細胞增殖分化和母性生殖過程中發揮重要的調控作用[14]。Li等[15]研究表明，Wnt信號通路對卵泡發育起負調控作用，其通過對轉錄因子Foxo3的激活影響顆粒細胞凋亡和卵泡類固醇的合成。

DKK2作為Wnt信號通路重要的抑制因子，在哺乳動物繁殖過程中發揮重要調控作用，但尚未見到DKK2基因調控牛顆粒細胞增殖分化的相關報道。DKK2基因在物種中保守性很高，在人、小鼠、牛、山羊和豬中CDS序列相似度高。本研究通過成功構建牛DKK2基因的pcDNA3.1表達載體，可為研究DKK2調控牛顆粒細胞發育的具體機制奠定基礎。

參考文獻：

[1] NIEHRS C. Function and biological roles of the Dickkopf family of Wnt modulators[J]. Oncogene， 2006， 25： 7469-7481

[2] BROTT B K， SOKOL S Y. Regulation of Wnt/LRP signaling by distinct domains of Dickkopf proteins[J]. Mol Cell Biol， 2002，22：6100-6110.

[3] DING Y， SHEN S Q， LINO A C， et al. Beta-catenin stabilization extends regulatory T cell survival and induces anergy in nonregulatory T cells[J]. Nature Medicine，2008，14：162-169.

[4] ZHANG Y， PENG S， KUANG H， et al. Expression and regulation of Dickkopf-2 during periimplantation in mice[J]. J Reprod Dev，2009，55：17-22.

[5] CHEN L， WANG K， SHAO Y， et al. Structural insight into the mechanisms of Wnt signaling antagonism by Dkk[J]. J Biol Chem， 2008， 283： 23364-23370.

[6] LI X， LIU P， LIU W， et al. Dkk2 has a role in terminal osteoblast differentiation and mineralized matrix formation[J]. Nat Genet， 2005， 37： 945-952.

[7] MUKHOPADHYAY M， GORIVODSKY M， SHTROM S， et al. Dkk2 plays an essential role in the corneal fate of the ocular surface epithelium[J]. Development，2006，133：2149-2154.

[8] BODINE P V， KOMM B S. Wnt signaling and osteoblastogenesis[J]. Rev Endocr Metab Disord，2006，7：33-39.

[9] FAN HY， LIU Z， SHIMADA M， et al. MAPK3/1 （ERK1/2） in ovarian granulosa cells are essential for female fertility[J]. Science，2009，324（5929）：938-941.

[10] VAN DEN HURK R， ZHAO J. Formation of mammalian oocytes and their growth， differentiation and maturation within ovarian follicles[J]. Theriogenology，2005， 63（6）：1717-1751.

[11] NELSON L R， Bulun SE. Estrogen production and action[J]. J Am Acad Dermatol， 2001， 45：8116-8124.

[12] MILLER J R. The Wnts[J]. Genome Biol，2002，3（1）：3001.

[13] HUANG H， HE X. Wnt/beta-catenin signaling： New （and old） players and new insights[J].Curr Opin Cell Biol， 2008， 20（2）：119-125.

[14] WANG S B， XING B S， YI L， et al. Expression of Frizzled 2 in the mouse ovary during oestrous cycle[J]. J Anim Physiol Anim Nutr （Berl）， 2010， 94（4）：437-445.

[15] LI L， JI SY， YANG J L， et al. Wnt/β-catenin signaling regulates follicular development by modulating the expression of Foxo3a signaling components[J]. Mol Cell Endocrinol， 2014， 382（2）：915-925.

（責任編輯 屠 晶）