離子排斥色譜法對發(fā)酵液中的L—赤蘚酮糖及赤蘚糖醇的測定

潘龍　祁靜　靳魁奇　鄭小娟　張磊　劉宇鵬

摘要：采用離子排斥色譜法對赤蘚糖醇及發(fā)酵產(chǎn)物L(fēng)-赤蘚酮糖進(jìn)行了分析。以高交聯(lián)度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球作為固定相的Aminex HPX-87C離子色譜柱為分析柱，利用示差折光檢測器分析了發(fā)酵液中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖。通過色譜條件優(yōu)化，選定了60 ℃柱溫和30%（V/ V）乙腈作為流動相。發(fā)酵液樣品中赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的平均回收率在97.2%～101.8%，精密度偏差在0.9%～2.4%范圍內(nèi)。

關(guān)鍵詞：L-赤蘚酮糖；赤蘚糖醇；示差折光檢測器；離子排斥色譜法

中圖分類號：O657.7+5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5719-03

Abstract：A method using ion exclusion chromatography was described for the simultaneous determination of erythritol and its metabolites L-erythrulose as products of fermentation. Erythritol and L-erythrulose were analyzed by a sulfonated polystyrene divinylbenzene column （Aminex HPX-87C） with a refractive index detector. It was found that the optimal conditions for separation were 60 ℃ column temperature and 30%（V/V） acetonitrile as mobile phase，which applied to the quantification. The results showed that the recoveries were in the range of 97.2%～101.8% and the precision CV ranged from 0.9%to 2.4%.

Key words： L-erythrulose； erythritol； refractive index detector； ion-exclusion liquid chromatography

赤蘚糖醇（Erythritol）[1]是一種具有清涼口感的填充型甜味劑，不僅擁有糖醇類產(chǎn)品的防止齲齒、適宜糖尿病患者等優(yōu)點，其相對甜度0.65，有清涼感，發(fā)熱量低，約為蔗糖發(fā)熱量的1/10。赤蘚糖醇溶于水（37%，25 ℃），溶解度低于蔗糖，易結(jié)晶，不易被酶降解，結(jié)腸中不發(fā)酵，只能透過腎排出，不參與糖代謝和血糖變化，宜于糖尿病患者食用。L-赤蘚酮糖（L-erythrulose）[2]是一種天然四碳酮醣，呈黏稠液態(tài)，溶于水，其醛糖形式是L-赤蘚糖。L-赤蘚酮糖可與皮膚外部或者老死表層中的角蛋白氨基酸發(fā)生反應(yīng)（表皮的角質(zhì)層），在化妝品工業(yè)中作為二羥基丙酮的替代品，解決了多數(shù)人群對二羥基丙酮的過敏問題。目前，L-赤蘚酮糖一般以赤蘚糖醇（meso-erythritol）為原料化學(xué)合成[3]，但此法繁瑣，且產(chǎn)物為消旋體手性化合物，拆分困難。微生物轉(zhuǎn)化法[4]合成，可通過發(fā)酵過程中的酶促反應(yīng)選擇性生成L型產(chǎn)物，且該法操作簡便，綠色環(huán)保。因此，以赤蘚糖醇為底物，通過微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-赤蘚酮糖逐漸引起人們的關(guān)注。

測定發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖的方法包括HPLC法[5]、薄層色譜法[6]和容量分析法[7]，其中薄層色譜法只能定性分析，無法精確定量；容量分析法易受發(fā)酵液中的雜質(zhì)干擾，無法精確測定；HPLC可直接進(jìn)樣，樣品不需要復(fù)雜前處理，因此更快捷和準(zhǔn)確。盡管國內(nèi)已有HPLC法分析赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的報道[5]，但一般采用氨基柱分析。

該試驗選用了高交聯(lián)度磺化苯乙烯-二乙烯基苯共聚物多孔微球的minex HPX-87C離子色譜柱[8]，分析了發(fā)酵液中的赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖。該法集合離子排斥，離子交換、配位體交換等多種分離機制，提供了較好的分離能力，分離效率大為提高。該研究可為赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖的定量分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1515型高效液相色譜儀，配備2414型示差折光檢測器，2489型紫外可見光檢測器，2707型自動進(jìn)樣器（美國Waters），Breeze色譜工作站。

L-赤蘚酮糖購于美國Sigma公司；赤蘚糖醇購于山東三元生物科技有限公司。

乙腈、甲醇均為色譜純試劑，蛋白胨和磷酸二氫鉀均為分析純，酵母粉為生化試劑，去離子水。

1.2 菌種

氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans 1.637）購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析 色譜柱BioRad公司Aminex HPX-87C柱，（300 mm×7.8 mm，9 μm）；柱溫40～60 ℃；流動相：乙腈-水梯度洗脫，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL；折光檢測器檢測赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖；檢測器溫度50 ℃。

1.3.2 發(fā)酵條件 發(fā)酵培養(yǎng)基配方（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）為赤蘚糖醇5%，蛋白胨0.5%，酵母粉1%，無水磷酸二氫鉀0.1%，碳酸鈣0.3%，pH 6.8；發(fā)酵條件：取對數(shù)期種子液，按5%接種量接入250 mL三角瓶，裝液量30 mL，pH 6.8，30 ℃振蕩（220 r/min）培養(yǎng)28 h。

1.3.3 樣品處理 取10 mL發(fā)酵液，離心除去菌體和沉淀，然后將上清液稀釋，再用0.45 μm的微孔濾膜過濾備用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取一定量標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)品濃度均為1.0 g/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖分離條件的研究

預(yù)試驗比較了C8和Aminex HPX-87C柱的分離效果，結(jié)果表明，Aminex HPX-87C分析發(fā)酵液中赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖，其目標(biāo)物和雜質(zhì)的分離度大于1，滿足分析要求。

L-赤蘚酮糖一般采用紫外檢測器測定[9]，但培養(yǎng)基中的酵母粉、蛋白胨中的組分對于定量分析干擾較大，為此，試驗選擇了示差折光檢測器分析發(fā)酵液中L-赤蘚酮糖及糖醇。該檢測器不僅可排除培養(yǎng)基中的成分干擾，并且能同時測定赤蘚糖醇和代謝產(chǎn)物L(fēng)-赤蘚酮糖，其檢測準(zhǔn)確度優(yōu)于紫外檢測器。

據(jù)報道，AminexHPX-87C色譜柱分析發(fā)酵液中的各種糖類[10]。此色譜柱推薦使用流動相為去離子水。由于赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖的結(jié)構(gòu)式相似，在色譜圖中這兩種物質(zhì)未能完全分開，在流動相中加入乙腈后（最大含量30%），赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖的分離度大于1。

柱溫和流動相中乙腈的濃度對離子色譜分離效果影響顯著[11]。試驗分析了流動相乙腈的濃度分別為10%、20%、30%，柱溫分別為40、50和60 ℃等9個條件，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在較低溫度和流動相濃度時，赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖的分離效果不佳。當(dāng)升高柱溫和增加流動相濃度時，赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖的分離較好，故選擇柱溫60 ℃，30%乙腈-水分析，該條件下的色譜圖見圖2。

2.2 外標(biāo)工作曲線和線性范圍的確定

將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述色譜條件下分析，以峰面積外標(biāo)法定量，赤蘚糖醇與L-赤蘚酮糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和參數(shù)見表1，由表1可知，該方法的線性較好，滿足分析需要。

2.3 樣品分析

以50 g/L的赤蘚糖醇為碳源，取發(fā)酵20 h的發(fā)酵液（稀釋50倍）進(jìn)行色譜分析，樣品色譜圖見圖3。

結(jié)果表明，樣品中的雜質(zhì)對分離無干擾，氧化葡萄糖酸桿菌發(fā)酵液樣品中的L-赤蘚酮糖達(dá)34.40 g/L，赤蘚糖醇達(dá)14.30 g/L。

經(jīng)回收分析，赤蘚糖醇和L-赤蘚酮的加標(biāo)回收率大于97%（表2），滿足分析要求。

3 小結(jié)

該法可同時定量分析發(fā)酵液中的L-赤蘚酮糖和殘余的底物赤蘚糖醇，發(fā)酵液中其他組分對測定不干擾。本研究采用的色譜條件不需對發(fā)酵液進(jìn)行處理，且能夠把赤蘚糖醇和L-赤蘚酮糖完全分開，分辨率高，線性范圍寬，能夠?qū)崟r提供發(fā)酵液中底物和產(chǎn)物含量變化的數(shù)據(jù)，結(jié)果可靠，該方法將為開發(fā)相關(guān)天然產(chǎn)物提供技術(shù)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 周有祥）