荷葉黃酮的提取和純化工藝研究

蔡敏　李長春　畢宏光　唐正宇　方翔

摘要：研究孝感本地生長的荷葉，通過超聲波輔助乙醇提取法，獲得荷葉黃酮的粗提物，再采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種不同大孔吸附樹脂進行分離純化，通過靜態吸附-解吸試驗對3種樹脂的純化工藝進行選擇。結果表明，在pH 6.5，溫度30 ℃，轉速180 r/min的恒溫振蕩器中，HPD-450的吸附量為95 mg/g、吸附率為39.38%、解吸率為50%，HPD-600的吸附量為98 mg/g、吸附率為40.66%、解吸率為70%，HPD-826的吸附量為112 mg/g、吸附率為46.89%、解吸率為56%。綜合考慮HPD-826型大孔樹脂對荷葉黃酮純化效果最佳，適用于精制荷葉黃酮。

關鍵詞：荷葉；黃酮；大孔樹脂；純化

中圖分類號：S682.32；R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）22-5691-03

Abstract： The lotus leaf of Xiaogan local growth was studied. The total lotus leaf flavonoids were obtained by ethanol ultrasonic assisted extraction. Three different macro porous absorption resin of HPD-450， HPD-600 and HPD-826 were used to separate and purify the flavonoids. Three kinds of resin purification process were optimized by static adsorption-desorption experiment. The result showed that the adsorption quantity of three kinds of resin were 95 mg/g， 98 mg/g， 112 mg/g， the adsorption rate were 39.38%， 40.66%， 46.89% and the desorption rate were 50%， 70%， 56% for HPD-600， HPD-450 and HPD-826 respectively under the conditions of pH 6.5， temperature 30 ℃， thermostatic oscillator in the speed of 180 r/min. The effects of temperature and the pH on dynamic adsorption were discussed. Therefore， macroporous resin of HPD-826 was suitable to refine lotus leaf flavonoids.

Key words： lotus leaf； flavonoids； macroporous absorption resin； extraction and purification

荷葉為睡蓮科（Nymphaeaceae）水生植物，資源豐富，主要分布在湖北、湖南、安徽、江西、福建、江蘇、山東等省份。荷葉的化學成分十分復雜，至今已從荷葉中分離出生物堿、黃酮類化合物等多種主要化學成分[1，2]。研究表明，荷葉中含有以槲皮素為主要成分的黃酮類物質，且含量豐富[3]。張贇彬等[4]從荷葉中分離出山萘酚和槲皮素-3-丙酯。Elegami等[5]從荷葉中分離出了Myricetin-3-（6-p-coumaroyl）-glucoside，Nympholide A和Nympholide B等黃酮類物質。延璽等[6]通過研究發現黃酮類化合物具有多種生理功能和抵抗疾病的作用。

通過研究孝感本地生長的荷葉，在試驗室條件下對荷葉黃酮類粗提物提取工藝研究的基礎上，使用大孔吸附樹脂HPD-450、HPD-600、HPD-826對荷葉黃酮類粗提物的分離純化效果優化，采用靜態吸附—解吸試驗和動態吸附—解吸試驗相結合的研究方法，獲得靜態吸附曲線、吸附率和解吸率，通過比較3種樹脂的各種參數，選出適當的樹脂對荷葉黃酮進行分離純化[7，8]。并且在此基礎上探討了pH、乙醇體積分數、恒溫振蕩器的溫度、轉速對大孔吸附樹脂吸附率和解吸率的影響[9，10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

新鮮荷葉分別于7月、8月和9月采集于孝感后湖公園中本土生長的荷葉品種。將采集的荷葉用電熱鼓風干燥箱在70 ℃下烘8 h，中草藥粉碎機粉碎，用60目篩子重復篩選3次得到荷葉粉末，裝袋密封，放置冰箱內，備用[11]。

1.2 試劑與設備

試劑：蘆丁標準品（貴州迪大科技有限公司）；大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH 均為分析純。

設備：中草藥粉碎機（天津市泰斯特有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；DL-480B型超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；DT5-2型低速臺式離心機（北京時代利離心機有限公司）；SHZ-III型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；ZHWY-211B型恒溫振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；UV-5200型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；FE20型pH計（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；TBD-2000型中壓層析制備系統（SHANGHAI TAUTO BIOTECH CO.，LTD.）；Φ5.0×40型層析柱（上海滬西分析儀器廠有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的制定 稱取10 mg蘆丁標準品，用30%乙醇標定在50 mL容量瓶中，配成濃度為0.200 mg/mL的蘆丁溶液，再分別取0、1、2、3、4、5 mL于25 mL的容量瓶中，在每個容量瓶中加入1 mL 5%的NaNO2振蕩6 min后加入l mL 5% Al（NO3）3，振蕩5 min，再加入10 mL 10%的NaOH，定容到刻度線，以空白試劑為參比液，于510 nm處測其吸光度，以吸光度A為縱坐標，濃度C為橫坐標繪制標準曲線（圖1）。

1.3.2 正交試驗設計 以影響荷葉黃酮提取率的乙醇體積分數、料液比（g∶mL，下同）、提取時間和提取溫度為4個影響因素，取各自的3個水平進行正交試驗，試驗的因素與水平見表1。

1.3.3 大孔吸附樹脂靜態吸附試驗 主要采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種樹脂進行靜態吸附和解吸試驗，3種樹脂均為白色不透明球狀顆粒，它們的性能指標見表2。用電子天平準確稱取已經預處理好的3種樹脂各1 g，分別放入3個干凈的150 mL的具塞錐形瓶，取荷葉黃酮提取液70 mL于燒杯，再準確量取60%乙醇140 mL加入燒杯，在每個150 mL的錐形瓶中加入稀釋后的提取液40 mL（測得pH為6.5），在不改變提取液pH的條件下，放入恒溫振蕩器中（30 ℃，180 r/min）靜態吸附，然后每間隔1 h測定錐形瓶上清液中黃酮的濃度。方法如下：分別用3個移液管，在每個移液管貼上標簽，準確量取錐形瓶上清液1 mL于3個25 mL的小燒杯，測定方法同標準曲線。測定得到其吸光度，帶入回歸方程公式即可得到錐形瓶中上清液黃酮的濃度。

按照下列算式計算出各種樹脂的靜態吸附量（mg/g）：

上式中，Q是靜態吸附量（mg/g）；C是初始濃度（mg/mL）；Cv是剩余濃度（mg/mL）；V是溶液體積（mL）；W是樹脂質量（g）。

假設吸附前與后提取液體積無變化，可按下列算式計算出樹脂的靜態吸附率：

1.3.4 大孔吸附樹脂靜態解吸試驗 待靜態吸附達到平衡狀態后，取出上述吸附飽和的3種大孔樹脂過濾，濾紙吸收樹脂表面的殘留溶液，然后放回錐形瓶，加入60%乙醇50 mL，置于恒溫振蕩器中（30 ℃，180 r/min）靜態解吸，每隔1 h收集一次上清液測定黃酮的濃度。

2 結果與分析

2.1 荷葉黃酮提取工藝結果

正交試驗優化荷葉黃酮試驗結果見表3。由表3可知，荷葉中黃酮提取的最佳試驗條件為B1A2C1D3，即料液比l∶20，60%乙醇，60 ℃，提取4 h。按照上述獲得的荷葉黃酮提取條件，將7、8、9月采集于孝感后湖公園本土生長的荷葉樣品分別進行浸提，通過紫外可見分光光度計檢測，吸光度代入蘆丁標準曲線線性回歸方程可得，7、8、9月荷葉樣品黃酮含量分別為7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量為7.88 mg/g，此時黃酮得率為0.788%。

2.2 大孔吸附樹脂靜態吸附結果

3種大孔樹脂靜態吸附在每個時間段的靜態吸附量見表4。運用Excel軟件繪制出3種樹脂的靜態吸附動力學曲線見圖2。由表4和圖2可知，HPD-826型大孔吸附樹脂在6 h左右吸附量就可以達到最大值112 mg/g，而HPD-450和HPD-600需在8 h左右達到飽和吸附量，分別為95、98 mg/g。在相同分離純化條件下HPD-826型大孔吸附樹脂達到平衡的時間相對短，吸附量較大，吸附率較高。

2.3 大孔吸附樹脂靜態解吸結果

恒溫振蕩器中30 ℃，180 r/min靜態解吸，每隔1 h收集一次上清液測定黃酮的濃度，3種大孔樹脂在每個時間段的靜態解吸率見表5。運用Excel軟件繪出3種樹脂的靜態解吸率曲線見圖3。由表5和圖3可知，3種樹脂的解吸平衡時間都在6 h左右，HPD-450、HPD-600和HPD-826型大孔吸附樹脂的解吸率分別是50%、70%和56%。

3 小結與討論

本研究首先通過正交優化試驗，確定超聲波輔助乙醇提取的最佳試驗條件為料液比l∶20，60%乙醇，溫度60 ℃，提取4 h。將處于生長期的荷葉樣品分別進行浸提，通過紫外可見分光光度計檢測，7、8、9月荷葉樣品黃酮含量分別為7.84、7.92、7.87 mg/g，平均含量為7.88 mg/g，此時黃酮得率為0.788%。

采用HPD-450、HPD-600、HPD-826 3種大孔吸附樹脂進行靜態吸附-解吸試驗，分析吸附量、吸附率和解吸率，結果表明，3種大孔吸附樹脂的吸附量和吸附率HPD-826>HPD-600>HPD-450，解吸率HPD-600>HPD-826>HPD-450。綜合3種大孔吸附樹脂的性能指標，HPD-826的吸附量最高，吸附平衡時間最短，而且解吸率適中，因此選取HPD-826型大孔吸附樹脂對荷葉黃酮純化精制。

對HPD-826型大孔樹脂動態吸附-解吸試驗過程發現，上清液的pH和溫度變化會影響荷葉黃酮與樹脂之間的吸附和解吸能力，大孔樹脂的吸附性隨著pH的增加先變大后減小，隨著溫度的增加變大。

參考文獻：

[1] 楊冀艷，胡 磊，許 楊.荷葉黃酮類化合物的研究進展[J].食品科學，2007，28（8）：554-558.

[2] 許金蓉.荷葉黃酮提取工藝及抗氧性研究[J].輕工科技，2014， 31（10）：15-18.

[3] 趙昕嵐，鄧放明.荷葉中總黃酮和荷葉堿含量變化規律[J].食品與機械，2013，29（2）：37-40.

[4] 張贇彬，戴妙妙，李彩俠.荷葉中黃酮類化合物的化學結構鑒定[J].食品研究與開發，2006，27（6）：45.

[5] ELEGAMI A A ，BATESC G，GRYAI H，et al. Two very unusual macrocylic flavonoids from water lilynymohaca lotus[J].Phytochemistry，2003，63（6）：731.

[6] 延 璽，劉會青，鄒永青，等. 黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J].有機化學，2008，28（9）：1534-1544.

[7] 于智峰， 王 敏.大孔吸附樹酯在黃酮類化合物分離中的應用[J].中藥材，2006，29（12）：1380-1382.

[8] 劉 云，劉良燚，朱欣婷.D140型大孔樹脂純化荷葉總黃酮的研究[J].安徽農業科學，2009，37（32）：16163-16164.

[9] 黃阿根，董瑞建，韋 紅，等.大孔樹脂對荷葉黃酮的分離純化[J].現代食品科技，2008，24（12）：1202-1206.

[10] 張 蕾，李梅香，吳秀玲，等.AB-8樹脂分離純化荷葉總黃酮的研究[J].食品研究與開發，2014，35（10）：42-45.

[11] 高 麗，王燕龍，熊云景，等.HPD-100大孔樹脂分離純化荷葉黃酮的研究[J].中國釀造，2012，31（8）：127-129.

（責任編輯 龍小玲）