石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠抗缺氧作用的研究

劉建新　李燕　凌紅　鄭禮肖　湯宣新

摘要：將小鼠分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，試驗(yàn)組小鼠通過腹腔注射分別給予不同劑量（20、40 mg/kg）的石仙桃總黃酮提取物，對(duì)照組腹腔注射生理鹽水（0.1 mL/10g），各組小鼠分別進(jìn)行常壓密閉缺氧試驗(yàn)、亞硝酸鈉引起的缺氧試驗(yàn)和負(fù)重游泳試驗(yàn)。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同劑量的石仙桃總黃酮提取物均顯著延長(zhǎng)了試驗(yàn)小鼠的常壓密閉缺氧存活時(shí)間、亞硝酸鈉引起的缺氧存活時(shí)間和負(fù)重游泳存活時(shí)間（P<0.05）。說明石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠有明顯的抗疲勞、抗缺氧作用。

關(guān)鍵詞：石仙桃；總黃酮提取物；抗疲勞；抗缺氧

中圖分類號(hào)：S285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）22-5668-03

Abstract：To study the fatigue-resisting and anoxia-resisting effect of the total flavones extracts from PhoIidota chinensis Iindl.，the mice were randomly individed to test group and control group，each group was injected total flavones extracts with different dots and normal saline and finally taken normobaric hypoxia test，NaNO2-induced hypoxia test and loading swimming test.The results showed that the survival time of the mice in test groups during all tests were all significantly prolonged（P<0.05）.It indicated that the total flavones from PhoIidota chinensis Iindl.had obvious anti-fatigue and and anti-hypoxia effects on mice.

Key words：PhoIidota chinensis Lind.；total flavones；anti-fatigue；anti-hypoxia

黃酮類化合物是廣泛存在于植物界的一大類多酚類化合物，具有良好的抗氧化活性、清除自由基及對(duì)心腦血管的保護(hù)等作用，并能提高機(jī)體抗疲勞和耐缺氧的能力。石仙桃系蘭科石仙桃屬植物石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）的全草，俗稱石上蓮、石橄欖、石穿盤等。始載于《生草藥性備要》。其性甘味涼，具有養(yǎng)陰、清熱、利濕、消瘀的功效[1]。民間常用于清肺、化痰止咳和抗疲勞等作用。石仙桃屬植物全球約30種，中國(guó)有14種，產(chǎn)于南方，尤以西南地區(qū)多見。據(jù)研究表明石仙桃主要化學(xué)成分為萜類、酚類、木脂素類、黃酮類，多糖等[2-5]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)石仙桃提取物具有抗缺氧及抗疲勞作用，本試驗(yàn)旨在研究其總黃酮化合物是否為石仙桃主要活性成分之一，并對(duì)其抗缺氧和抗運(yùn)動(dòng)性疲勞作用進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)昆明種小鼠，體重（20+2） g，雌雄兼有，自由取食，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：No.43004700005357。

石仙桃總黃酮提取物的制備：總黃酮測(cè)定采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH分光光度比色法[6]，精確稱取蘆丁對(duì)照品2.70 mg，用70%乙醇溶解，用10 mL容量瓶定容至刻度，配成0.27 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，分別取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL至10 mL具塞試管中，加水至5 mL，加5%亞硝酸鈉0.6 mL，搖勻靜置6 min，加10%硝酸鋁0.6 mL，搖勻靜置6 min，加4%氫氧化鈉3.0 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻靜置15 min。另取一支10 mL具塞試管，不加對(duì)照品溶液，只加顯色劑，按照上法制成空白對(duì)照液。采用紫外可見分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取2.000 g石仙桃粗粉至500 mL微波提取罐中，在一定功率、一定時(shí)間、一定溫度、一定液料比、一定濃度乙醇的條件下提取，減壓抽濾，回收濾液至少量，用70%乙醇定容至50 mL，制成待測(cè)溶液。取待測(cè)溶液5 mL，加入15 mL 70%乙醇，搖勻。取稀釋液2 mL，顯色，制成10 mL顯色液及空白對(duì)照液，在510 nm下測(cè)定其吸光度，按回歸方程計(jì)算出樣品溶液中的總黃酮含量（mg/mL），根據(jù)稀釋倍數(shù)及樣品質(zhì)量計(jì)算出樣品中總黃酮的含量（mg/g）。然后通過石仙桃總黃酮的微波輔助提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在最佳工藝條件即微波功率300 W、提取時(shí)間 30 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶20（g/mL）、80%乙醇條件下，測(cè)定其吸光度，計(jì)算得石仙桃提取物中總黃酮含量為31.41 mg/g。制備4 mg/mL石仙桃總黃酮提取物，供試驗(yàn)時(shí)使用。

1.2 儀器

WF-4000C型常壓微波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；Lambda35型紫外可見分光光度計(jì)（美國(guó)鉑金埃爾默公司）；DZF-6050型烘箱（上海一恒科技有限公司）；EYELAN-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）。

1.3 方法

1.3.1 石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響 將小鼠隨機(jī)均分為3組，每組10只，分別腹腔注射給予不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10 g）。給藥20 min后，將小鼠放置在密封的250 mL含鈉石灰的廣口瓶中（瓶?jī)?nèi)放鈉石灰10 g，每瓶放小鼠1只），瓶口涂凡士林密閉。觀察小鼠至最后一次呼吸為止，用秒表記錄時(shí)間，即為小鼠的存活時(shí)間。

1.3.2 石仙桃總黃酮提取物對(duì)亞硝酸鈉引起的小鼠缺氧的影響 將小鼠隨機(jī)均分為3組，每組10只，分別腹腔注射給予不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10g）。給藥40 min后，分別按200 mg/kg的劑量腹腔注射給予亞硝酸鈉，觀察小鼠至最后一次呼吸為止，用秒表記錄時(shí)間，即為小鼠的存活時(shí)間。

1.3.2 石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳存活時(shí)間的影響 將小鼠隨機(jī)均分為3組，每組10只，分別腹腔注射不同劑量的石仙桃總黃酮提取物（20、40 mg/kg）和生理鹽水（0.1 mL/10g）。給藥40 min后，在小鼠尾根部負(fù)其體重3%的鉛絲，置于水溫30 ℃、水深35 cm、直徑40 cm、桶高為50 cm的水桶中，每只水桶放入1只小鼠。用秒表記錄小鼠自游泳開始至力竭下沉且8 s不能浮出水面的時(shí)間作為其游泳至力竭的時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.50統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠常壓耐缺氧的影響

由表1可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠常壓耐缺氧時(shí)間均比生理鹽水對(duì)照組長(zhǎng)，且與生理鹽水對(duì)照組相比差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達(dá)顯著水平（P<0.05）。提示石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地提高了小鼠的耐缺氧能力。

2.2 石仙桃總黃酮提取物對(duì)亞硝酸鈉引起的小鼠缺氧的影響

由表2可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠耐組織性缺氧生存時(shí)間均比生理鹽水對(duì)照組延長(zhǎng)，且與生理鹽水對(duì)照組相比差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達(dá)顯著水平（P<0.05）。表明石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地延長(zhǎng)了亞硝酸鈉所致組織性缺氧小鼠的存活時(shí)間。

2.3 石仙桃總黃酮提取物對(duì)小鼠負(fù)重游泳存活時(shí)間的影響

由表3可見，石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組小鼠負(fù)重游泳存活時(shí)間均比生理鹽水對(duì)照組延長(zhǎng)，且與生理鹽水對(duì)照組相比差異均達(dá)顯著水平（P<0.05）；石仙桃總黃酮提取物高、低劑量組間差異也達(dá)顯著水平（P<0.05）。表明石仙桃總黃酮提取物呈劑量依賴性地延長(zhǎng)了小鼠負(fù)重游泳存活時(shí)間。

3 小結(jié)與討論

在缺氧代償期，由于酸性代謝產(chǎn)物如乳酸和二氧化碳的蓄積，反射性地引起呼吸加深加快，心跳加強(qiáng)加快，增加心搏出量以及血液重新分配，最大程度地保證心臟和大腦等重要器官的最高血氧飽和度及血液供應(yīng)。到缺氧晚期，持續(xù)的嚴(yán)重缺氧造成供氧不足而發(fā)生不可逆的機(jī)能障礙和損傷，甚至發(fā)生組織壞死和機(jī)體死亡。本試驗(yàn)結(jié)果表明，石仙桃總黃酮提取物能明顯延長(zhǎng)小鼠缺氧條件下存活時(shí)間，增強(qiáng)小鼠的應(yīng)激反應(yīng)能力，對(duì)機(jī)體重要器官心、腦在缺氧條件下的損傷起到了一定的保護(hù)作用。亞硝酸鈉對(duì)機(jī)體的缺氧損害機(jī)制主要是使血液中的低鐵血紅蛋白氧化成高鐵血紅蛋白，從而造成血紅蛋白失去運(yùn)輸氧的能力，引起組織缺氧性損害。通過這兩種耐缺氧試驗(yàn)，顯示石仙桃總黃酮提取物不僅能提高供氧不足環(huán)境下的小鼠的生存能力，也能提高組織性缺氧環(huán)境下的小鼠的存活能力，表明石仙桃總黃酮提取物可提高機(jī)體對(duì)不同條件下的缺氧適應(yīng)能力和生存能力。石仙桃總黃酮提取物能明顯延長(zhǎng)小鼠游泳存活時(shí)間，提高有氧條件下的運(yùn)動(dòng)能力，增加心肌工作能力的儲(chǔ)備，具有有效提高運(yùn)動(dòng)能力和抵抗疲勞的作用。

綜上所述，中藥石仙桃不僅含有豐富的黃酮組分，而且石仙桃的黃酮組分是其抗疲勞和耐缺氧的重要活性成分之一。藥材標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)目應(yīng)以功能主治一致的有效成分為測(cè)定指標(biāo)，因此本研究可為該藥材標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，也為進(jìn)一步開發(fā)該藥材的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 曾德芳）