閩南地區食源性動物組織中黃曲霉毒素B1殘留量調查研究

朱蘇琴 張志剛＊ 葉葆衡 黃印堯,2 李國平,3

（1.廈門銀祥集團有限公司肉食品安全生產技術國家重點實驗室 福建廈門 361100；2.廈門出入境檢驗檢疫局 福建廈門 361012；3.福建農林大學 福州 350002）

黃曲霉毒素（Af1atoxin，AFT）主要為真菌黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產生的次級代謝物，主要的生物學效應是致癌、致畸及致突變作用。 現已發現的有 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1等10多種，彼此結構十分相似，都含有一個決定毒性的雙呋喃環和一個與致癌有關的氧雜萘鄰酮（香豆素），其中AFB1毒性最強，其毒性為砒霜的68倍，氰化鉀的10倍，已被聯合國列為一類致癌物[1-2]。高劑量時可導致急性死亡，低水平持續性攝入可產生慢性毒性。目前，世界上有1/4的糧食被霉菌毒素污染，其中黃曲霉毒素污染最為嚴重[3]，黃曲霉毒素污染已成為全球性的難題。據統計，我國黃曲霉毒素污染率達90%，其中15%～25%已達到重度污染而禁用，尤其是在氣候溫濕的南方地區污染尤為嚴重，不僅給農業經濟帶來巨大損失，更為嚴重的是，殘留在動物組織中的AFT可通過食物鏈進入人體并富集，最終誘發肝癌、腎癌、胃癌等，嚴重威脅人類健康。為此，自1960年發現黃曲霉毒素以來，各國紛紛制定了黃曲霉毒素限量標準，我國飼料中黃曲霉毒素（AFB1）限量標準不超過20 ug/kg，豬肉組織中AFB1不超過5 ug/kg，而歐盟制定的標準最為嚴格，即豬肉組織中AFB1不超過2 ug/kg。

已有較多的研究報道了食品、飼料、花生、玉米、牛乳等黃曲霉毒素污染水平[4-7]，而直接研究動物臟器及肌肉組織內富集AFB1水平的報道極少，史瑩華等[8]利用免疫親和柱凈化結合高效液相色譜法測定了組織樣品中的黃曲霉毒素。本研究以氣候相對潮濕的閩南地區為背景，以飼喂的食源性動物豬、雞、鴨肝臟及肌肉組織為材料，應用酶聯免疫吸附（ELISA）技術測定樣品中的AFB1含量。一方面直接調查評估閩南地區食源性動物組織中AFB1的殘留量，間接反映了閩南地區食源性動物飼料中AFB1的污染程度，為領導部門規范養殖業提供理論依據；除此之外，本研究還檢測了國外進口豬肉中AFB1含量。

1 材料與方法

1.1 材料 檢測的食源性動物組織樣本均采集于閩南地區廈門、漳州、泉州各畜禽養殖場和肉品市場，雞肝臟、鴨肝臟、豬肝臟各40份，本地土種豬肉，白毛豬肉各40份；從英國、丹麥、西班牙、加拿大進口豬肉各10份，共40份（由廈門出入境檢驗檢疫技術中心提供）。

1.2 方法 采用酶聯免疫吸附（ELISA）技術進行檢測，樣品的前處理與檢測方法按照試劑盒（購于美國bioo scientific）進行，檢測限為 0.05 ug/kg。

1.2.1 樣品制備 肝臟樣品制備（稀釋倍數：4倍）：取適量樣品研磨混勻后稱取2 g于50 mL離心管中，加入6 mL乙腈和2.5 mL樣品平衡液，渦旋振蕩10 min，加入200 uL肝臟提取液，渦旋振蕩1 min，4 000 g離心10 min。取600 uL上清液到干凈離心管中，60～70℃氮氣吹干樣品，用800 uL的35%甲醇/PBS溶解干燥樣品，渦旋混勻1 min，取50 uL作ELISA檢測用。

肌肉樣品制備（稀釋倍數：10倍）：取適量樣品研磨混勻后稱取5 g于50 mL離心管中，加入25 mL 70%甲醇，搖床振蕩20 min，于4 000 g室溫離心10 min。取上清液以1:1的比例和PBS混合，取50 uL作ELISA檢測用。

1.2.2 ELISA檢測 分別加入50 uL不同濃度的AFB1標準品及待測樣品于微孔板中，加入100 uL AFB1抗體，輕輕混勻1 min，室溫下孵育30 min，加入250 uL Wash so1ution洗板3次，洗完后將酶標板于紙上輕拍至干，加入150 uL HRP酶標抗體，輕輕混勻1 min，室溫下孵育30 min，加入250 uLWash so1ution洗板3次，洗完后將酶標板于紙上輕拍至干，加入100 uL TMB，輕輕混勻1 min，室溫下孵育15 min后立即加入100 uL終止液，置于酶標儀于450 nm波長測量OD值。

1.3 數據分析 計算每個濃度標樣或樣品在450 nm處的平均吸光度值和空白 （標樣AFB1濃度為0 ng/mL）在450 nm處的平均吸光度值，然后計算出每個濃度標樣或樣品所對應的AFB1（固相）與抗AFB1抗體的最大結合率（%）。

以最大結合率為縱坐標，標樣濃度為橫坐標制作標準曲線，樣品中AFB1含量可根據該標準曲線獲得。用SPSS13.0統計軟件分析數據，結果以平均值±標準偏差（X±Sd）表示。

2 結果與分析

2.1 AFB1的標準曲線 以AFB1標準濃度為橫坐標，最大結合率為縱坐標制得AFB1標準曲線（見圖1），曲線方程公式為 Y=198.0X2-265.4X+95.09（R2=0.991），待檢樣的AFB1濃度值可根據所測的OD值，由標準曲線方程公式得出對應的濃度值。

圖1 AFB1的ELISA標準曲線

2.2 不同動物肝臟組織中AFB1檢測 不同動物組織中黃曲霉毒素B1的檢測水平見表1。由表1可知，雞、鴨、豬3種動物肝臟中AFB1的檢出率分別為65%、75%、100%，超標率均為0%；平均含量分別為 （0.302 ± 0.034）ug/kg、 （0.289 ± 0.022）ug/kg、（1.498± 0.274）ug/kg。SPSS 13.0統計學分析結果表明，豬肝臟中AFB1含量最高，顯著高于雞、鴨肝臟中 AFB1 含量（P＜0.01）；雞、鴨肝臟中 AFB1 含量相對較低，且二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。

以上檢測結果說明，飼喂的食源性動物組織中AFB1含量雖未超出國家限量標準，但具有超高的檢出率，均為AFB1污染。且飼喂時間較長的豬肝臟組織內的AFB1含量極顯著高于飼喂時間較短的雞鴨肝臟中 AFB1含量（P＜0.01）；這可能是由于 AFB1在動物體內的存在是一個富集的過程，因此，殘留量與動物飼喂AFB1污染的飼料的時間成正比，雞鴨的平均飼喂時間為90 d左右，而豬為180 d左右，這就不難理解豬肝臟內的AFB1殘留量顯著高于雞鴨肝臟。這在一定程度上也說明了動物采食AFB1污染的飼料時間越長，AFB1在體內殘留就越多，而且在肝臟中殘留比肌肉多。

2.3 豬肌肉組織中AFB1檢測水平 豬肌肉中AFB1檢測水平見表2。由表2可知，中國與國外進口的豬肌肉中黃曲霉毒素B1的檢出率均為100%，超標率均為0%。中國土豬、中國菜豬，進口豬瘦肉中AFB1的平均含量依次為 （0.811±0.497）μg/kg、（0.863 ± 0.261）μg/kg、（0.912 ± 0.051）μg/kg。 SPSS13.0統計學分析表明，國外豬肌肉中AFB1含量雖略高于國內，但均無顯著性差異（P＞0.05），且都低于表1中豬肝臟內AFB1含量，表明豬肝臟內AFB1含量高于其他組織。這與楊其名[9]報道的泔水豬肝臟中AFB1含量最高，腎臟次之，瘦肉最低結果一致。以上檢測結果說明，國內外飼料喂養型豬肌肉組織中AFB1含量雖未超出國家限量標準，但檢出率均為100%。含量顯著高于健康人。許菊萍等[14]研究表明當AFB1濃度達到1.0 g/mL時能促進肝癌細胞的增殖活動。有研究報道AFT可顯著降低豬的生長性能、顯著降低肝內酶活性而導致肝功能嚴重損傷[15]，AFB1可通過食物鏈富集于人體，其攻擊的靶器官為肝臟，即使是微量的AFB1，若長期攝入，也具有慢性毒性，最終將導致癌癥尤其是肝癌的發生。可以想象動物或人類長期大量攝入受AFB1污染的飼料或食物，后果

表1 不同動物肝臟組織中AFB1檢測水平

表2 豬肌肉組織中AFB1檢測水平

3 小結與討論

1）應用酶聯免疫吸附（ELISA）技術對閩南地區食源性動物（雞、鴨、豬）肝臟和肌肉組織以及國外進口豬肉中的黃曲霉毒素B1殘留量進行抽樣檢測。結果顯示所有檢測樣品中黃曲霉毒素B1均具有很高的檢出率，其中豬肉、豬肝均為100%、雞肝65%、鴨肝75%，但都低于國家限量標準；豬肝臟中AFB1含量最高，顯著高于豬肌肉和雞、鴨肝臟中AFB1含量（P<0.01）；而雞、鴨肝臟中的AFB1含量無顯著性差異（P>0.05）；此外，國外進口豬肉樣品中AFB1檢出率100%，但未超標；Chiavaro[10]報道了源于意大利北部各農場的50份豬肝臟樣本AFB1和AFM1的檢測結果，所有樣本AFB1含量均低于1.0μg/kg，而本研究結果顯示豬肝臟AFB1平均含量為1.498±0.274 μg/kg，在一定程度上說明了我國豬肝臟內AFB1污染較國外更為嚴重，須給予重視。檢測結果表明，食源性動物組織中黃曲霉毒素B1殘留普遍存在。

2）黃曲霉毒素，尤其是黃曲霉毒素B1對人類健康的危害極大。研究表明，肝癌的發生與黃曲霉毒素污染密切相關，在已明確的肝癌致癌因素中，AFB1、HBV和HCV位居前3位[11]，尤以AFB1為著。流行病學調查顯示，AFB1高污染地區肝癌的發病率明顯高于低污染地區[12]，周元平等[13]以肝癌患者的肝組織為研究材料，結果表明肝癌患者肝組織中AFB1將不堪設想。

3）飼料為導致豬肉組織中黃曲霉毒素超標的極為重要的來源。我國飼料中黃曲霉毒素污染問題普遍存在，田西學等[16]報道了陜南關中地區飼料黃曲霉毒素B1檢出率72.37%，超標率4%。王若軍等[17]從福建、廣東、內蒙古、北京、遼寧、湖南、浙江等地采集動物、植物蛋白飼料、青貯飼料、菌體蛋白飼料、玉米等進行黃曲霉毒素普查，結果表明黃曲霉毒素污染雖不嚴重超標，但普遍存在。業內人士都很清楚，飼養霉變飼料的家禽家畜，常常出現家禽曲霉菌病害，保育舍小豬、中豬出現陰戶腫脹的假發情癥狀等，還會導致呼吸與消化系統的疾病，機體免疫力下降，生長緩慢。

4）要去除食源性動物組織中AFB1殘留問題，首先要解決飼料霉變這個全球性問題。近年來，霉菌毒素脫毒處理技術成為研究熱點，主要有物理、化學、生物方法，可以使霉菌毒素不同程度去除或者失活，物理、化學脫毒法存在“二次污染”問題，而生物脫毒法成為一種更為安全有效的去除黃曲霉毒素的方法，如黃曲霉毒素解毒酶、乳酸菌、葡甘露聚糖等[18-20]都能在一定程度上起到解毒的作用，但至今還沒有一種較為理想、經濟、有效的好方法。面對飼料霉菌污染問題，首先要加強飼料防霉的防范意識，在飼料原料管理、儲存、運輸加工等環節必須嚴格把關，做好防霉措施。從源頭上預防霉菌的侵害，這是當前最有效的防治方法。

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