發酵時間對水豆豉理化特性和MCF-7人乳腺癌細胞體外抑制作用的影響

趙 欣 騫 宇

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

發酵時間對水豆豉理化特性和MCF-7人乳腺癌細胞體外抑制作用的影響

趙 欣 騫 宇

（重慶第二師范學院生物與化學工程系，重慶 400067）

水豆豉是一種短時間發酵的黃豆制品，采用理化試驗和癌細胞體外試驗，通過pH、酸度、總菌數、氨基酸態氮含量、銨態氮含量、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GTP）活性、感官評價、MTT試驗和RT-PCR，評價不同發酵時間水豆豉的理化特性和體外抑制作用。隨著發酵時間的增加，pH值和總菌數增加，發酵48 h水豆豉的蛋白質含量、酸度、γ-GTP和活性大豆異黃酮（大豆黃素和金雀異黃素）含量都比其他發酵時間水豆豉高，在感官評價上48 h發酵的水豆豉也優于其他發酵時間的水豆豉。48 h發酵的水豆豉也具有對MCF-7人乳腺癌細胞最強的生長抑制作用，且48 h發酵水豆豉處理后的MCF-7細胞的Bax，caspase 3，9基因的表達強于其他發酵時間的水豆豉，Bcl-2基因則弱于其他發酵時間的水豆豉。結果顯示48 h發酵的水豆豉具有最好的理化品質和體外抗癌效果。研究結果為改善水豆豉生產工藝提供理論支持。

水豆豉 理化特性 發酵時間 MCF-7 人乳腺癌細胞 抗癌

豆豉是我國的黃豆傳統發酵制品，味道鮮美可口，既能調味又能入藥，傳統中醫認為豆豉性具有解表清熱、透疹解毒的作用［1］，長期食用還可開胃增食、消積化滯、祛風散寒。水豆豉是細菌型豆豉，是由黃豆經過細菌發酵而成的釀造調味食品，其含水量比其他類型豆豉大，且在堆積發酵過程中能水解產生一些特殊氣味［2］。水豆豉營養豐富，含有多種蛋白質，維生素和礦物質的含量也較高［3-4］。

發酵時間是影響發酵食品品質和功能性作用的重要因素，在提高酸菜、發酵醬類、醋和醬油等傳統發酵食品品質的研究中，是研究的重點［5-8］。將黃豆浸泡后蒸煮熟，在26～45℃下發酵48～72 h，黃豆之間產生黏狀絲后表示發酵完成，再加入鹽、辣椒粉、花椒粉和植物油等調味料，低溫保存1至2周，緩慢后發酵以增加香味［9］。大豆制品中含有多種功效成分，迄今，我國關于水豆豉對乳腺癌的生理功效的影響，特別是生產工藝與水豆豉抗乳腺癌的研究明顯不足。MCF-7人乳腺癌復細胞作為一種代表性研究用細胞株已經被充分運用在食品功能性作用的研究中。本研究對不同發酵時間水豆豉的理化品質進行了量化比較，對發酵時間與人乳腺癌細胞體外抑制作用之間的關系進行了初步研究，為確定水豆豉最佳發酵時間，促進高品質水豆豉的科學生產及抗乳腺癌提供了一定的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑龍江農墾總局大西江農場（黑龍江省嫩江縣）產優質黃豆（拉丁名為Glycinemax），采收于2012年秋季，采用高濕度人工收獲方式收獲黃豆后自然日光曬干后低溫密閉貯藏待用。

AM505-K銨態氮試劑盒、AM158-Kγ-谷氨酰轉肽酶試劑盒：韓國Asan公司；D-生物素、L-組氨酸鹽酸鹽、D-葡萄糖-6-磷酸、NADP（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、大豆黃素和金雀異黃素標準品、3-（4，5-二甲基噻唑 -2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT試劑）：美國Sigma公司；DMSO（二甲基亞砜）：日本純正化學株式會社；RPMI 1640培養液、FBS、trypsin（胰蛋白酶）、EDTA、100 unit／mL青霉素-鏈霉素溶液：美國Gibco公司。MCF-7人乳腺癌細胞：美國典型培養物保藏中心（ATCC）。

1.2 儀器與設備

WPL-30恒溫培養箱：江東精密儀器有限公司；UV-1750紫外分光光度計：日本島津公司；MC096型二氧化碳培養箱：日本三洋電機株式會社；Elx800型酶標儀：美國Bio Tekinstruments公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 水豆豉制作

根據文獻［10］中水豆豉的制作方法，精選后的黃豆經蒸餾水（黃豆量的2倍）浸泡12 h，然后將其置于高壓蒸氣滅菌鍋中，在105℃蒸煮60min。蒸煮后冷卻至45℃，再將蒸煮黃豆后剩余的蒸豆水進行過濾，4℃冷藏保存至豆豉發酵結束。冷卻后的黃豆置于40℃恒溫培養箱中，分別自然發酵24、48和72 h，最后加入黃豆質量10%的蒸豆水于發酵后的黃豆中制成不含調味料的水豆豉。將發酵好的水豆豉進行冷凍干燥，再用乙醇提取3次后蒸干，將蒸干后的乙醇提取物用二甲基亞砜溶解后冷藏保存待用。

1.3.2 基本營養物質的含量測定

水分含量采用直接干燥法，在105℃的干燥箱中測定；粗蛋白質含量采用微量凱氏定氮法測定；粗脂肪含量采用索格利特萃取法測定；粗灰分含量采用直接灰化法測定；粗纖維含量采用AOAC法測定［11］。

1.3.3 pH和酸度的測定

水豆豉樣品打碎后用10倍的蒸餾水稀釋，然后用pH計測定其pH值。1 g打碎的水豆豉樣品用20 mL蒸餾水稀釋后用0.1 mol／L的NaOH滴定至pH 8.3，計算樣品的酸度公式為：總酸度＝

1.3.4 總菌數測定

1 g打碎的水豆豉樣品用無菌生理鹽水稀釋10倍，涂抹在平板計數瓊脂（PCA）上，30℃培養48 h觀察菌落數，采用平板計數法對總菌數（CFU／mL）進行數菌［12］。

1.3.5 氨基酸態氮、銨態氮含量和γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GTP）活性的測定

取2 g樣品采用甲醛值法測定氨基酸態氮含量，將水豆豉粉碎后加10倍量水稀釋后再過濾，吸取5.0 mL過濾液，置于100 mL容量瓶定容，吸取20 mL，置于200 mL燒杯中，加入60 mL水，用0.1 mol／L的NaOH滴定至pH 8.3。再加入10 mL甲醛溶液后用0.1 mol／L的NaOH繼續滴定至pH 8.3，同時另做1份以20 mL蒸餾水代替樣品溶劑，重復以上步驟得到空白試驗滴定消耗NaOH的量，記錄所消耗的NaOH量，按下式計算氨基酸態氮的量［2］。

氨基酸態氮含量／mg%＝［樣品消耗NaOH量（mL）-空白試驗消耗NaOH量（mL）］×NaOH濃度（mol／L）×0.014／水豆豉取樣質量（g）×100

樣品粉碎后用蒸餾水稀釋5倍振蕩提取后過濾得到的濾液用AM505-K試劑盒采用Indophenol比色法進行銨態氮含量的測定，過濾液按要求加入試劑盒試劑后放置20 min后用分光光度計在635 nm處測定吸光度，通過下式計算得到銨態氮含量［13］。

取10 g樣品用5倍蒸餾水稀釋后振蕩，用離心機離心取上層澄清液，然后用158-K試劑盒采用aminolicylic acid法進行γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GTP）活性的測定［14］按下式計算。

1.3.6 活性異黃酮含量的測定

分別將大豆黃素和金雀異黃素標準品用體積濃度為80%乙醇溶解，配制成質量濃度為0.002～0.020 g／L標準溶液。以 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×25 mm，5μm）；流動相：40%甲醇；流速為1.0 mL／min；檢測器靈敏度為 0.02 AUFS；檢測波長為260 nm；柱溫為50℃；取標準溶液20μL注入六通閥中，測定峰面積。得到大豆黃素標準曲線回歸方程Y＝148 338+1.70×108X（R2＝0.995 5）；金雀異黃素標準曲線回歸方程Y＝-316 706+4.20×108X（R2＝0.995 5）。取不同時間發酵水豆豉樣品2 g，粉碎后加10倍量水稀釋后4 000 r／min離心得到上清液，在80℃烘箱中干燥。干燥物用200 mL體積濃度為80%的乙醇在80℃恒溫水浴中回流提取2 h，回流提取2次。合并提取液，減壓蒸干，用無水乙醇定容至10.00 mL作為待測液，將待測液測定后對照標準曲線得到含量值。

1.3.7 水豆豉的感官評價

對水豆豉的感官性質采用感官定量分析法，以9分評分制進行感官評價。30名經過感官評價的感官評價員分別對水豆豉樣品的外觀、黏性、氣味、質感、甘甜味、苦澀味、風味、綜合口感和總體評價進行評分。評分標準為：極不喜歡或極弱（1分），不喜歡或較弱（3分），可接受或中等（5分），喜歡或強烈（7分），極喜歡或極強烈（9分）［15］。

1.3.8 水豆豉提取物的體外癌細胞增殖抑制效果的測定

將MCF-7人乳腺癌復細胞蘇后接種在含10%滅活小牛血清的RPMI1640培養液中，將癌細胞放置在37℃，5%的CO2培養箱中培養，每周更換培養液2～3次并傳代培養1次。將含癌細胞培養液以每孔200μL接種于96孔培養板，培養液的癌細胞濃度為1×104個／mL。然后將96孔培養板放入培養箱中繼續培養24 h。吸出96孔板中各孔的培養液，加入水豆豉乙醇提取物的培養液200μL。48 h培養后，再次吸出各孔內上清液，各孔再加入200μL濃度5 mg／mL的MTT試劑后繼續培養4 h后吸出各孔內的上清液，在每孔中加入200μL的DMSO后避光振蕩30 min，用酶標儀在540 nm波長下測定各孔OD值，按下式計算：

1.3.9 RT-PCR分析

同等條件下用RNAzol試劑制備MCF-7人乳腺癌細胞總RNA。定量分離到RNA后，以oligo dT為引物，在AMV逆轉錄酶作用下制備ss cDNA，然后以該cDNA為模板，RT-PCR法擴增 Bax，Bcl-2，caspase-3，9基因（表1）。持家基因 glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作為內參照。試驗結束后，以1%瓊脂電泳（含濃度溴化乙錠）檢查PCR擴增產物［17］。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 數據統計

使用SAS統計軟件采用one-way ANOVA法對數據進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間水豆豉的一般成分比較

由表2可知，48 h發酵的水豆豉在粗蛋白質含量上高于24和60 h發酵的水豆豉；48 h發酵的水豆豉的粗脂肪和灰分含量低于24和60 h發酵的水豆豉；水豆豉的水分含量和粗纖維含量隨著發酵時間的增加而減小。

表2 不同發酵時間水豆豉的成分對比／%

2.2 不同發酵時間水豆豉的pH、酸度和總菌數

從表3可以看出，水豆豉的pH值和總菌數隨著發酵時間的增加而減小，發酵時間為48 h的水豆豉的酸度值略高于24 h發酵水豆豉，低于60 h發酵水豆豉。

表3 不同發酵時間水豆豉的pH、酸度和總菌數

2.3 不同發酵時間水豆豉的氨基酸態氮、銨態氮和γ-GTP的含量

隨著發酵時間的增加，水豆豉的氨基酸態氮和銨態氮含量明顯增加，特別是在發酵初期，表現的最為明顯，48 h發酵后的氨基酸態氮和銨態氮含量均約為24 h發酵水豆豉的3倍。48 h發酵的水豆豉含有最高含量的γ-GTP，60 h發酵的水豆豉的 γ-GTP含量略高于24 h發酵的水豆豉（圖1）。

圖1 不同發酵時間水豆豉的氨基酸態氮、銨態氮含量和γ-GTP含量

2.4 不同發酵時間水豆豉的大豆異黃酮含量

樣品處理后，在色譜條件下測定，對照標準曲線從回歸方程中求得樣品的濃度并換算出樣品中大豆黃素和金雀異黃素的含量。由圖2可知，48 h發酵的水豆豉中大豆黃素和金雀異黃素的含量均高于24和60 h發酵水豆豉，隨著發酵時間的進行，當發酵到48 h前，活性大豆異黃酮的含量迅速增加，然后其含量隨發酵的進行略微下降。

圖2 不同發酵時間水豆豉的活性大豆異黃酮含量

2.5 不同發酵時間水豆豉的感官評價

由圖3可知，通過感官評價員的感官評價，觀察到48 h發酵的水豆豉在外觀、氣味、質感、風味、綜合口感和總體評價上都表現出最好的嗜好度，得到最高的評分。在黏性評分上，隨著發酵時間的增加，黏性的評分越高，在甘甜味評分上48 h發酵的水豆豉表現出比24和60 h發酵水豆豉更高的強度，在苦澀度比較上，24 h發酵的水豆豉表現出很強的苦澀度，48和60 h發酵后苦澀度均明顯降低。感官評價得到的結果與理化測定得到的結果相對應，48 h發酵的水豆豉在包括香味物質氨基酸態氮、銨態氮和γ-谷氨酰轉肽酶的含量上高于24和60 h發酵水豆豉，其在氣味、風味，綜合口感上都優于另外的水豆豉。

圖3 不同發酵時間水豆豉的感官評價

2.6 不同發酵時間水豆豉對癌細胞體外增殖抑制效果的比較

采用MTT法，檢測水豆豉對MCF-7人乳腺癌細胞的體外抑制增殖效果。由表4可知，不同發酵時間水豆豉提取物處理癌細胞后的OD值讀數發生明顯變化，48 h發酵水豆豉的OD值低于24和60 h發酵水豆豉，通過計算可以得出48 h發酵水豆豉對MCF-7癌細胞具有最強的生長抑制效果。

表4 不同發酵時間水豆豉對MCF-7人乳腺細胞的體外增殖抑制效果

2.7 不同發酵時間水豆豉對癌細胞Bax、Bcl-2、caspases基因的mRNA表達影響

用水豆豉提取物處理MCF-7人乳腺癌細胞，發現，48 h發酵水豆豉處理過的 MCF-7癌細胞的Bax、caspase-3和caspase-9表達最強，60 h發酵水豆豉處理過的癌細胞的Bax、caspase-3和caspase-9表達強于24 h發酵水豆豉；Bal-2的mRNA表達則表現出相反的趨勢（圖4），并且經過定量分析后可以看出各組之間具有顯著的差異性（P＜0.05）。

圖4 不同發酵時間水豆豉對MCF-7人乳腺癌細胞的Bax、Bcl-2和caspasesmRNA表達的影響

3 討論

發酵時間是影響發酵產品品質的一個重要方面，對發酵產品的成分、風味和功能性作用等都有很大的影響，特別是對水豆豉的滋味有較大的影響。氨基酸態氮有利于食品產生鮮味［18］，銨態氮是一種帶有刺激性氣味的物質［19］，從試驗結果來看，水豆豉隨著發酵時間的增加，其氨基酸態氮和銨態氮含量都明顯升高，60 h發酵的水豆豉兩者含量最高，氨基酸態氮較48 h發酵水豆豉增幅幅度不大，但是銨態氮增幅較大，所以雖然其鮮味比48 h發酵水豆豉好，但同時其刺激味卻大幅度增加。γ-GTP是一種能產生香味成分的酶［20］，48 h發酵水豆豉的γ-GTP含量高于其他發酵時間水豆豉。通過測定3種主要的香味物質，發現48 h發酵水豆豉具有最好的香氣組成。結合感官分析結果，48 h發酵的水豆豉在各項評價指標中均表現出最好的嗜好度，香味和甘甜度，發酵也降低了苦澀味，在整體的感官評價上優于其他發酵時間的水豆豉。在對乳腺癌細胞的體外癌細胞抑制效果評價上，首先觀察受試物對癌細胞體外增殖抑制效果，通過癌細胞增殖的情況可以從一定程度上判斷受試物的抗癌功效［21］。相對于其他發酵時間的水豆豉，初步判斷，48 h發酵水豆豉對癌細胞的生長抑制效果最好，具有更好的體外抗癌效果。Bcl-2基因是一種原癌基因，它具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可與促凋亡Bax形成二聚體，Bax相對量高于Bcl-2時，Bax同二聚體的數量增多，從而促進細胞死亡［22］。Caspase基因選擇性地切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡，caspase-9為凋亡途徑的上游 caspase，caspase-3為下游 caspase，caspase-9作為啟動性caspase，隨著表達的加強可以加強對下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞內的結構蛋白和功能蛋白，引起凋亡［23］，Bax、caspase-3和caspase-9表達增強及Bcl-2表達減弱均能證明具有誘導癌細胞凋亡的癌細胞抑制功效。通過進一步的分子生物試驗，觀察到48 h發酵的水豆豉也表現出對癌細胞凋亡最強的誘導效果。大豆中含有的大豆異黃酮具有很好的抗癌效果，同時發酵后的大豆制品中部分大豆異黃酮可轉化為更易發揮抗癌功效的大豆黃素和金雀異黃素這2種活性異黃酮物質［24］，能更好的起到對癌細胞的抑制作用。48 h發酵水豆豉中這2種活性大豆異黃酮含量最高，由此產生的體外癌細胞抑制功效也最強。

4 結論

在40℃下采用自然發酵時，48 h發酵的水豆豉具有最好的理化品質和對MCF-7人乳腺癌細胞體外抑制效果，但是發酵食品的生產是一個復雜的工藝，溫度、時間、菌種和水分等都是影響發酵的重要因素，這些因素相互之間的影響會改變其他因素的狀態，所以多因素結合確定最佳的功能性水豆豉的生產條件有待進一步的研究。

［1］胡國軍，吳天祥.豆豉營養評價及其粗纖溶酶活性檢測［J］.中國釀造，2010（10）：95-99

［2］趙欣，冉龍江，邵林楠.水豆豉和納豆的理化特性及抗突變效果的比較［J］.濰坊教育學院學報，2008（21）：49-50

［3］夏巖石，夏延斌，楊撫林，等.豆豉的營養與保健功能［J］.中國食物與營養，2005（2）：48-50

［4］石彥國.大豆制品工藝學［M］.第二版.北京：中國輕工業出版社，2005：144

［5］吳成軍.食鹽濃度和發酵時間對泡菜中亞硝酸鹽含量的影響［J］.生物學教學，2006，31（3）：55-56

［6］鄭劍明.醬油發酵工藝條件的探討［J］.中國調味品，2002（8）：11-13

［7］邵偉，唐明，藏占鋒，等.傳統豆瓣醬釀造工藝改進與優化研究［J］.中國釀造，2010（3）：130-132

［8］黃持都，魯緋，張建.豆醬研究進展［J］.中國釀造，2010（6）：4-6

［9］艾靜汶，王修俊，周沅潔，等.貴州特色食品水豆豉生產工藝與質量變化關系的研究［J］.中國調味品，2013（38）：64-68

［10］Zhao X，Song JL，Wang Q，et al.Comparisons of Shuidouchi，Natto，and Cheonggukjang in their physicochemical properties，antimutagenic and anticancer effects［J］.Food Science and Biotechnology，2013，22（4）：1077-1084

［11］Yoo SM，Chang CM.Study on the processing adaptability of soybean cultivars for Korean traditional chonggugjang preparation［J］.J Korean Soc.Agric.Chem.Biotechnol，1999，42（2）：91-98

［12］Zhao X，Bak SS，Rhee SH，etal.Fermentation period influences on antimutagenic and in vitro anticancer effects of Shuidouchi［J］.Journal Food Science，Cancer Prevention Research，2008，13（1）：40-46

［13］Weatherburn M W.Phenol-hypochorite reaction for determination of ammonia［J］.Journal of Analytical Chemistry，1967，39（8）：971-974

［14］Im C M，Kwon SH，Bae M S，et al.Characteristics and increased antimutagenic effect of black soybean（Var.Seoritae） Chungkukjang［J］.Cancer Prevention Research，2006，11（3）：218-224

［15］Peryam D R，Pilgrim F J.Hedonic scalemethod ofmeasuring food preference［J］.Food Technology，1957（11）：9-14

［16］Zhao X，Wang Q，Qian Y，et al.Cassia tora L.（Jueming-zi）has anticancer activity in TCA8113 cells in vitro and exerts anti-metastatic effects in vivo［J］.Oncology Letters，2013，5（3）：1036-1042

［17］Zhao X，Wang Q，Qian Y，et al.Kudingcha（Ilex kudingcha C.J.Tseng）has in vitro anti-cancer activity in MCF-7 human breast adenocarcinoma cells and exerts anti-metastatic effects in vivo［J］.Oncology Letters，2013，5（5）：1744-1748

［18］張曉麗，胡明輝，付作杰.醬油中氨基酸態氮的檢測及結果分析［J］.中國衛生工程學，2008，7（3）：191

［19］何惠萍.按態氮影響醬油質量［J］.中國調味品，1996（7）：15-16

［20］芮漢明，郭凱.γ-GTP對香菇熱風干燥香氣形成的影響及其性質研究［J］.食品工業科技，2008，29（1）：153-155

［21］王剛，趙欣.兩種白茶的抗突變和體外抗癌效果［J］.食品科學，2009，30（11）：243-245

［22］Delic′R，?tefanovic′M.Optimal laboratory panel for predicting preeclampsia［J］.Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine，2010，23（1）：96-102

［23］Blanc C，Deveraux Q L，Krajewski S，et a1.Caspase-3 is essential for procaspase-9 processing and cisplatin-induced apoptosis of MCF-7 breast cancer cells［J］.Cancer Research，2000，60：4386-4390

［24］韓婷，程鋼，劉瑩，等.β-葡萄糖苷酶以及益生菌生物轉化大豆異黃酮糖苷的研究進展［J］.食品科學，2010，31（9）：333-337.

Influences of Fermentation Period on Physicochemical Properties of Black Cured Beans and MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Vitro

Zhao Xin Qian Yu

（School of Biological and Chemical Engineering，Chongqing University of Education，Chongqing 400067）

Black cured beans is a kind of short time-fermented soybean food.In this study，physicochemical and in vitro cancer cells experiments were used to evaluate the physicochemical properties and anticancer effects of different fermented time black cured beans.The pH，acidity，total viable count，amino acid nitrogen content，ammonium nitrogen content，activity ofγ-GTP，sensory evaluation，MTT and RT-PCR were determined.As the fermentation time increased，the pH and total viable count increased in black cured beans.Black cured beans fermented for 48 h exhibited the highest contentof crude protein，acidity，γ-GTP and activity of soybean isoflavones（daidzein and genistein）than others.The sensory evaluation of 48-hour-fermented black cured beans was better than those of black cured beans in other fermentation periods.The 48-hour-fermented black cured beans showed the best growth inhibitory effect in MCF-7 human breast cancer cells.The 48-hour-fermented black cured beans increased the Bax，caspase 3 and 9 genes of MCF-7 cells，and decreased the Bcl-2 gene compared with black cured bean in other fermentation periods.Therefore，the 48-hour-fermented black cured beans showed the best physicochemical quality and in vitro anticancer effects.The results provide the theoretical foundation formanufacturing technique of black cured beans.

black cured beans，physicochemical properties，fermentation period，MCF-7 human breast cancer cells，anticancer

TS218

A

1003-0174（2015）01-0027-06

重慶第二師范學院教改項目（JG20132206），重慶高校創新團隊建設計劃（KJTD201325）

2013-09-18

趙欣，男，1981年出生，教授，食品營養學

騫宇，女，1976年出生，講師，食品營養學