異體骨髓間充質干細胞對EAE大鼠神經再生保護作用的研究

何展文 劉木金 孟 哲 李平甘 羅向陽 李棟方 梁立陽

中山大學孫逸仙紀念醫院兒科 廣州 510120

炎癥性脫髓鞘疾病是以神經髓鞘脫失為主要或始發病變的神經系統疾病，近來研究顯示軸索損害和神經功能損傷同樣參與其病理生理過程，而且可能是疾病后期導致持續不可逆神經功能障礙的主要原因［1-2］。如何能取得更滿意的治療效果，治療上不僅需要免疫調節，更需要神經保護再生治療。骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）不僅具有免疫調節功能，而且具有多向分化能力，可分化成神經系統的神經元和神經膠質細胞，為細胞移植治療炎癥性脫髓鞘疾病開拓了新道路。本實驗研究擬在實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）大鼠模型免疫后早期靜脈輸注BMSCs，觀察輸注后大鼠臨床癥狀和神經功能變化，利用免疫組化方法檢測神經元特異性烯醇化酶（NSE）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）、2’，3’-環腺苷酸-3’-磷酸二酯酶（CNPase）表達，觀察移植后的BMSCs在EAE 大鼠體內存活、增殖、分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞情況，了解BMSCs對EAE的神經再生的修復作用。

1 材料與方法

1．1 實驗動物 健康雌性SD 大鼠，體質量190～220g，購自廣東省醫學動物實驗中心，合格證號：廣東省實驗動物檢測所合格證2008-0002號。本校北校區動物實驗中心按SPF級飼養，環境溫度25 ℃，濕度70%，適應性喂養1周，除實驗時間外，可自由攝食和飲水。健康Wistar大鼠，200g左右，購自中山大學實驗動物中心，合格證號：廣東省實驗動物檢測所合格證2008-0562號。

1．2 主要實驗材料 胎牛血清、DMEM 培養基購自美國HyClone公司，胰蛋白酶購置上海吉泰科技有限公司。FITC mouse IgG1 購 自BD pharmingen 公 司；Mouse anti-rat CD44、PE anti-rat CD3、PE mouse IgG1、PE anti-rat CD4、PE anti-rat CD8、PE anti-mouse／rat CD25 購 自Serotec 公 司；FITC anti-rat CD90、PE anti-rat CD106、PE anti-rat CD45、PE mouse IgG2a、PE anti-rat CD11b／c、PE Armenlan Hamster和PE anti-mouse／rat CD29 購 自Biolegend 公 司；CD34 PE 購 自Santa Cruz Biotechnology 公 司。MBP68-86（bs-0380p）購自北京博奧森生物技術有限公司。完全佐劑購自廣州捷倍斯生物科技有限公司。百日咳疫苗購自河北石家莊偉天科學儀器設備有限公司。NSE 鼠多克隆抗體、GFAP鼠多克隆抗體、CNPase鼠多克隆抗體購自英國Abcam 公司。SA1022 兔IgG 試劑盒、SA1021 小 鼠IgG 試劑盒 和AR1022DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．3 BMSCs的分離培養和表型鑒定 斷頸處死Wistar大鼠，放置超凈臺上，剪開大鼠后肢皮膚，充分暴露剝離腿部肌肉，取出股骨和脛骨。剪去其兩端骨骺，于10cm2培養皿內使用含10%胎牛血清的DMEM 培養液沖洗骨髓。用骨髓間質干細胞完全培養基反復吹打使之形成單細胞懸液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養液，接種于培養瓶中，37 ℃、5%CO2培養。貼壁3d后換液，每隔3d換液直至傳代，待細胞80%～90%融合的時候傳代，第4代（P4）用于實驗。用0．25%胰蛋白酶消化收集細胞移入離心管中，1 100r／min離心4min，棄去上清。加PBS溶液重懸細胞，吸取100μL 細胞懸液（約3．0×105個細胞）加入EP管內。按量加入與PE或FITC標記的IgG1、CD34、CD44、CD45、CD11b／c、CD29、CD90、CD105單克隆抗體，避光孵育30min，上機檢測。

1．4 方法

1．4．1 實驗分組：SPF 級SD 大 鼠45 只，按體質量大小編號，隨機分為3組，分別為EAE模型組、正常對照組、EAE模型BMSCs移植組。EAE模型組：每只大鼠用10%水合氯醛按體質量0．3mL／100g經腹腔注射麻醉至四肢松弛，75%酒精消毒足墊，四足墊皮下注射含有100μg（0．4 mL）的MBP68-86-CFA 混合免疫乳劑，免疫當日及2d后分別在兩側腹股溝皮下注射百日咳疫苗0．1mL（約1×109個菌體）；免疫當天分別在尾靜脈靜注0．4mL等量生理鹽水。以免疫當天為第0天。正常對照組：方法和步驟同上，但免疫誘導劑采用生理鹽水制成的混合乳劑，注射后當日及2d后分別在兩側腹股溝皮下注射0．1 mL 生理鹽水。EAE 模型BMSCs移植組：采用上述方法建立EAE 模型，免疫后第5天在尾靜脈靜注CFSE標記后BMSCs（4×106／只，0．4mL），大鼠共20只，隨機分為4組，分別在移植后第7天、15天、21天及30天處死。

1．4．2 神經功能評價：免疫后所有動物每天稱體質量并進行神經功能評分：0分：正常；1分：鼠尾張力障礙；2分：部分后肢癱瘓或步態不穩；3分：完全后肢癱瘓；4分：完全后肢癱瘓加部分或完全前肢癱瘓；5分：瀕死狀態或死亡；癥狀介于兩條標準之間者用±0．5分表示。

1．4．3 免疫組織化學檢測：各組大鼠按相應的時間點以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，用100mL 預冷的多聚甲醛經主動脈灌流至無血液流出時，小心取出脊髓及腦組織于10%福爾馬林中保存。冠狀位切取小段頸髓及部分腦組織，石蠟包埋，連續切片，片厚5μm。分別進行NSE、GFAP、CNPase免疫組織化學檢測，觀察輸注后大鼠腦內及脊髓處的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的表達情況。組織切片置于二甲苯中浸泡10min，更換后再PBS浸泡10min；無水乙醇中浸泡5min；95%乙醇中浸泡5min；90%乙醇中浸泡5min；80%乙醇中浸泡5min；70%乙醇中浸泡5min；蒸餾水中浸泡5min。用3%H2O2，室溫封閉10min，蒸餾水洗3次，PBS洗2次。滴加5%BSA 封閉液，室溫20min，甩去多余液體。滴加NSE（1∶100）、GFAP（1∶4 000）和CNPase（1∶1 600）一抗，4℃過夜，PBS洗3次。滴加相應的生物素化二抗，37 ℃20min，PBS洗3次。滴加鏈霉素化親和素試 劑，37 ℃20 min，PBS 洗4 次。DAB 顯色試劑盒顯色。蘇木素復染2 min、飽和磷酸氫二鈉分化。脫水、透明、封片。光學顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒的為陽性細胞。每張切片選擇10個表達最強的視野，計數陽性細胞數后取平均值。

1．4．4 腦和脊髓的病理組織學檢查：動物處死后，取腦室周圍及脊髓腰膨大部位組織標本，石蠟包埋，切片5μm 厚，行HE染色和髓鞘染色，并在光鏡下進行組織學評分，0：無炎癥變化；1：炎癥細胞浸潤僅限于血管周圍和脊膜周圍；2：脊髓內輕微的炎癥細胞浸潤（1～10個細胞／片子）；3：脊髓內中度的炎癥細胞浸潤（11～100個細胞／片子）；4：脊髓內嚴重的炎癥細胞浸潤（＞100個細胞／片子）。

1．5 統計學處理 所有數據均采用SPSS 16．0軟件進行數據統計。計量資料采用均數±標準差（±s）表示。采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。檢驗水準α＝0．05，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 BMSCs分離培養與表型鑒定結果 原代培養的骨髓細胞接種第3天，部分貼壁生長，多呈長梭形、三角形和多角形，即為BMSCs；于第7～12天開始增長明顯加快，具有一定的方向性，呈束狀或放射狀排列；第14天左右，單種細胞數量多，細胞貼壁率達90%。傳代培養的BMSCs形態多為長梭形，較原代細胞體積增大，增殖速度加快，貼壁能力增強，約7d貼壁率達80%～90%。通過流式檢測第4代Wistar大鼠BMSCs的表型，結果顯示：強 表 達CD29、CD44 和CD90，少量表達CD34 和CD106，幾乎不表達CD11b 和CD45。

2．2 BMSCs對EAE大鼠神經功能評分的影響 所有EAE模型大鼠未治療時均出現不同程度的臨床癥狀，表現為精神反應欠差，活動及進食減少，體質量下降，毛發疏松或脫毛，失去光澤，全身縮成一團，弓背，腹脹，尾巴無力，后肢、前肢、偏癱或全身癱瘓，部分出現共濟失調，瀕死甚至死亡。我們在免疫后第5天靜脈輸注BMSCs，BMSCs移植組大鼠高峰期評分及整個病程的平均評分較EAE模型組顯著降低（P＜0．05）（表1），且發病時間延遲，發病率降低。

2．3 免疫組織化學檢測 EAE 模型組和BMSCs移植組NSE陽性細胞較正常對照組明顯減少，其中在移植后第15天和第21天減少最明顯（P＜0．05）。BMSCs移植組在第7天陽性細胞數較EAE 模型組表達水平增多，但并無顯著性差異，而第15天、第21天和第30天NSE陽性細胞數明顯高于EAE模型組的表達水平（P＜0．05）（表2、圖1）。各個時間點GFAP陽性細胞數無論是EAE 模型組還是BMSCs移植組，與正常對照組的表達水平并無顯著性差異（表3、圖2）。EAE模型組CNPase染色陽性細胞數較正常對照組明顯減少（P＜0．05）。BMSCs移植組在第7天陽性細胞數較正常對照組表達水平降低（P＜0．05），隨著時間遷移，BMSCs移植組CNPase染色陽性細胞數表達逐漸增加，各時間點CNPase染色陽性細胞數明顯高于EAE 模型組的表達水平（P＜0．05）（表4、圖3）。

2．4 BMSCs對EAE腦脊髓病理檢查的影響 腦脊髓病理檢查示EAE組大鼠腦和脊髓內多處血管“袖套”樣改變，表現為血管周圍大量炎癥細胞浸潤，神經元變性，部分出現膠質細胞結節。BMSCs移植組與EAE 模型組比較，各時間點病理示炎癥細胞浸潤顯著減少，脫髓鞘改變也顯著減輕，神經元變性數目明顯減少。

表1 各組大鼠神經功能評分

表2 不同時間大鼠腦組織切片NSE染色陽性細胞數比較 （±s，n＝5）

表2 不同時間大鼠腦組織切片NSE染色陽性細胞數比較 （±s，n＝5）

注：EAE group 比 較，＊ P ＜0．05，與Negative control group，△P＜0．05

組別7d 15d 21d 30d EAE group 14．63±6．36△ 8．34±4．22△ 6．25±2．59△ 6．85±3．25△Negative control 24．37±4．12 BMSCs group 17．28±4．62 15．47±3．78△16．78±4．59＊△18．41±4．25＊

圖1 NSE在大鼠腦中表達情況

表3 不同時間大鼠腦組織切片GFAP染色陽性細胞數比例 （±s，n＝5）

表3 不同時間大鼠腦組織切片GFAP染色陽性細胞數比例 （±s，n＝5）

組別7d 15d 21d 30d EAE group 15．31±4．08 16．19±3．84 15．87±3．53 15．01±4．3 5 Negative control 14．48±3．53 BMSCs group 13．73±4．66 14．53±2．99 15．45±4．55 16．09±3．2 2

圖2 GFAP在大鼠腦中表達情況

表4 不同時間大鼠腦組織切片CNPase染色陽性細胞數比較 （±s，n＝5）

表4 不同時間大鼠腦組織切片CNPase染色陽性細胞數比較 （±s，n＝5）

注：與EAE group 比 較，＊P＜0．05，與Negative control group比較，△P＜0．05

組別7d 15d 21d 30d EAE group 10．66±4．53△ 11．87±4．0△ 10．27±3．97△ 12．47±3．29△Negative control 22．65±5．79 BMSCs group 16．35±4．74△ 19．25±3．95＊ 20．21±4．32＊ 25．43±5．04＊

圖3 CNPase在大鼠腦中表達情況

3 討論

炎癥性脫髓鞘疾病本身可能是炎癥反應和神經退行性損傷的參與發病過程。炎癥反應、髓鞘脫失和軸突損害是中樞神經系統炎癥性脫髓鞘疾病三個重要病理改變。炎癥反應導致脫髓鞘改變，炎癥反應和髓鞘破壞損傷軸突，最終導致神經退行性損傷。目前對于炎癥性脫髓鞘疾病主要是免疫調節治療，但由于缺乏有效髓鞘再生機制，軸突損害或神經元不可逆的損傷，導致其治療效果往往并不理想。近年來，不少神經病學學者致力研究脫髓鞘疾病神經損傷機制及如何促進神經保護再生，發現通過細胞生物治療可以改善局部損傷微環境，從而促進髓鞘或神經再生，促進形成新的突觸聯系和信息傳導恢復。

BMSCs作為骨髓造血干細胞的基質支持細胞，是一群多功能的干細胞，在特定的培養條件下分化為骨、脂肪、軟骨和肌肉等結締組織，也可分化成神經系統的神經元和神經膠質細胞。Priller等［3］在大鼠紋狀體注射人BMSCs細胞，發現有20%移植的細胞能長時間在大鼠腦中存活并廣泛分布于腦中，遷移路徑和神經干細胞及星形細胞的遷移路徑相同；同時移植后BMSCs失去BMSCs在培養中的典型特征而表現許多神經細胞的特征。Akiyama等［4］在脊髓損傷大鼠動物模型通過靜脈輸注BMSCs能顯著改善脊髓損傷后髓鞘再生。同樣Satake等［5］在脊髓橫斷損傷動物模型中鞘內注射BMSCs也能促進脊髓損傷后髓鞘再生和運動功能恢復。研究結果表明，BMSCs生物治療有利于神經系統損傷疾病修復，顯示出可觀的神經再生可塑性。本實驗在EAE 免疫后早期靜脈輸注CFSE標記的BMSCs，觀察輸注后大鼠神經功能變化及病變部位的標記細胞分布，利用免疫組化方法檢測NSE、GFAP、CNPase表達，觀察BMSCs移植后EAE 大鼠體內神經元（NSE）、星形膠質細胞（GFAP）和少突膠質細胞（CNPase）數量，了解BMSCs對EAE 的神經再生的修復作用及遷徙分化情況。

本實驗中采用NSE、GFAP、CNPase抗體均為小鼠抗大鼠抗體，具有高度特異性，分別檢測移植后不同時間點神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞表達情況，結果顯示在EAE模型組，NSE 和CNPase的表達較正常對照組顯著下降，提示在EAE模型中可能存在不同程度神經元和少突膠質細胞的損傷凋亡。目前研究顯示在EAE 和MS的病灶內存在少突膠質細胞、神經元、小膠質細胞、巨噬細胞等多種細胞的凋亡，并在疾病的發病和病情發展中有重要的作用［6］。少突膠質細胞是髓鞘形成細胞，具有形成和修復髓鞘的能力，影響軸突的生長、結構以及功能。少突膠質細胞的凋亡影響髓鞘的結構和功能，引起髓鞘脫失，繼發或加重軸突的損傷［7］。

研究顯示，BMSCs植入實驗動物體內后具有增殖、遷徙和分化的能力，可調節EAE 大鼠的免疫紊亂并分化為髓鞘形成細胞，刺激髓鞘再生，促進神經功能修復。關于BMSCs在炎癥性脫髓鞘疾病中神經再生保護的機制尚未完全闡明，目前認為可能與下列幾種因素有關：（1）BMSCs植入體內能向損傷處遷徙并向神經元、神經膠質細胞分化并替代死亡的宿主細胞，與局部殘存的細胞重新建立聯系，恢復神經元回路［8-9］。（2）BMSCs可分泌多種細胞因子及神經生長因子，改善局部微環境并啟動再生相關基因的表達，促進軸突功能的再生［10-11］。Bianco等［12］將BMSCs植入動物體內后，可導致IL-6、IL-7、IL-12和腦源性神經營養因子（BDNF）等多種細胞因子分泌增多，這些細胞因子對神經損傷修復起重要作用，同樣可能對免疫調控起一定作用。（3）BMSCs能夠抑制神經元的凋亡，并使殘存的脫髓鞘的神經纖維和新生的神經纖維髓鞘化，從而恢復神經結構的完整性［8，13-14］。

綜上，預防給予BMSCs可以明顯改善EAE大鼠神經缺損癥狀及縮短病程，可能機制是通過免疫調節，抑制免疫反應所致的神經細胞損傷，減少神經元和少突膠質細胞的凋亡，從而發揮神經保護作用，但不能排除仍有部分BMSCs在局部微環境信號的誘導下向脫髓鞘區遷徙并分化為髓鞘形成細胞的可能。本研究為BMSCs在臨床上炎癥性脫髓鞘疾病治療提供了理論依據。

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