速激肽受體1基因啟動子近端E盒點突變對下游基因調控的影響

陳玲群，王練紅，周 金，王 林(懷化市第二人民醫院檢驗科，懷化 48000;湖南醫藥學院檢驗系)

速激肽受體(neutokinin receptor，NKR1-3)屬于G蛋白偶聯跨膜受體家族，主要表達在中樞神經細胞、骨髓基質和乳腺細胞等組織［1］，其中NK1R基因轉錄成兩種mRNA，分別翻譯成全長型(NK1R-Fl)和截斷型(NK1R-Tr)受體，兩型受體翻譯起始點一樣，mRNA前1 520 nt序列相同，二者所不同的是表達產物C端不一樣，而C末端在細胞內，不同的C末端直接造成了兩類受體截然不同的信號傳導通路［2］。NK1R受體基因轉錄起始點上游調控區存在E盒結構。我們初步對NK1R基因轉錄起始點上游近段E盒結構進行點突變，通過熒光素酶報告基因載體［3］，研究E盒結構的突變是否會影響下游基因的表達。

1 材料和方法

1.1 材料

胎牛血清(Fetal bovine serum.FBS)與 DMEM/F12培養液購自美國Hyclone公司;胰酶消化液購自北京天潤善達生物制品有限公司;Promega限制性核酸內切酶:mluⅠ、HxoⅠ，LB 液體培養基(pH7.4)與動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(D1700)購自北京索萊寶科技有限公司;Biospin膠回收試劑盒BSC02M1、去內毒素質粒提取試劑盒(QIAGEN)、Roche FuGene轉染試劑、雙熒光素酶檢測試劑盒、PGL4.74 hluc內參質粒購自 Promega公司;PGL3-basic熒光素酶報告基因載體系列;HBL-100、MCF-7細胞系來自湖南醫藥學院。

1.2 克隆含近端E盒結構啟動子

1.2.1 野生型NK1R啟動子的克隆 定位近端E盒“CACATG”結構位點，根據近端E盒位置利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0設計引物，擴增含一個近端E盒結構的DNA序列。

HBL-100細胞用含100 ml/L胎牛血清的DMEM，置于37℃、50 ml/L CO2細胞培養箱中培養，提取基因組DNA，作為擴增模板。巢式PCR擴增目的DNA片段，外向引物(nkw1上游引物:CAGGATTCTGGAGCTTCGTAT，nkw1下游引物:CTACCGTTTGAAATGGTCTTG)。擴增程序:94℃預變性120 s，然后以94℃ 30 s，52℃ 復性30 s，68℃ 延伸70 s進行35個循環，68℃ 延伸10 min，4℃保存。以外向擴增產物為模板，用內向引物(NK1R上游引物:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGGCACCTCT，NK1R下游引物:AGCCACGCGTCTGAGCGACAAGCTGCCTA)擴增，具體程序同前，延伸時間設為60 s。對第二輪PCR產物純化回收，得到NK1R野生型啟動子，產物長度為827 bp。

1.2.2 重疊延伸PCR對NK1R啟動子近端E盒點突變 將巢式PCR產物純化回收后作為模板，進行重疊延伸PCR，引入點突變CACAT G→CACAC G。第 一 輪 PCR 用 p1，p2引 物(p1:CGCCCTCGAGAGTTTCGCGGG CACCTCT，p2:CATCGCCCCCACACACGACCGTTTCCCATTG)擴增短片段，p3，p4 引物 (p3:CAATGGGAAACGGTCGTGTGTGGGGGCGATG，p4:CACAACGCGTACCTCTTGTGCAGCCGCTCTA)擴增長片段;完成擴增后，純化回收。第二輪PCR:把純化后的長、短片段放到同一個反應管中，相互作為模板和引物，反應4個循環。第三輪PCR:以第二輪全長PCR產物為模板進行擴增，用p1，p4引物，即擴增出帶有點突變的啟動子。將PCR最后產物電泳，純化回收。

1.2.3 野生型和突變型熒光素酶報告基因構建把純化的野生型和突變型NK1R啟動子PCR產物以及PGL3-basic分別進行mluⅠ和HxoⅠ雙酶切，酶切產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化回收。然后用T4 Ligase對PGL3-basic分別與NK1R野生型和突變型啟動子進行連接，連接反應體系為:T4 Ligase(Trans)3.5 μl，NK1R 8 μl，ddH2O 7 μl，5 ×buffer(Trans)5 μl，PGL3-basic 6 μl，16 ℃ 連接過夜，另設PGL3-basic自連反應體系，確保酶切后的PGL3-basic不自連。轉化感受態細菌DH5α，用滅菌玻璃棒把連接產物轉化的菌液均勻涂布到100 μg/ml氨芐青霉素LB固體培養基上，37℃培養12-16 h。每個平板挑取4個菌落，分別置入100 μg/ml氨芐青霉素LB液體培養基培養過夜。每支LB菌液取1 ml送北京奧科生物公司測序，序列比對合格的菌落再進行培養。提取去內毒素質粒。用測序和XhoⅠ/mluⅠ 雙酶切電泳對啟動子片段進行鑒定，測得濃度為 360 μg/ml，A260/280=1.847。

1.3 雙熒光素酶檢測試劑檢測啟動子活性

復蘇MCF-7乳腺癌細胞，為了確保細胞良好狀態接受轉染，從復蘇到細胞轉染至少傳至兩代。設定MCF-7組，MCF-7-NK1R野生組，MCF-7-NK1R突變組;質粒為 PGL3-basic-NK1R+PGL4.74 hluc，PGL4.74 hluc作為內參加入到所有試驗組，PGL3-basic空載體轉染 MCF-7作為對照，PGL3-basic-NK1R野生型轉染野生組，PGL3-basic-NK1R突變型轉染突變組。把消化后的細胞轉移至96孔板，每組5孔，細胞培養至70%-80%融合時即開始轉染。轉染前2 h，把每孔培養基調節至100 μl。FuGene Reagent和質粒DNA平衡至室溫，用前混勻。吸取85 μl Opti-MEM1 Reduced Serum Medium 至各個稀釋孔中，按質粒(μg):FuGene Reagent(μl)=2∶7 的比例配制質粒DNA(包括內參質粒)和FuGene Reagent混合物，室溫放置15 min。每孔加7 μl FuGene Reagent和質粒DNA混合物，培養板水平充分混勻后置入細胞培養箱培養。轉染后培養30 h檢測熒光素酶表達情況。檢測試劑Dual-Glo Luciferase Buffer與Luciferase Substrate混勻;Stop Glo Substrate與Stop Glo Buffer按1∶100混合混勻。檢測前把待測細胞孔內的培養基調至75 μl，平衡至室溫，每孔加 75 μl Dual-Glo Luciferase Buffer＆ Luciferase Substrate混合液，混勻后室溫靜置10 min，檢測OD值，作為數據1。每孔再加75 μl Stop Glo Substrate＆Stop Glo Buffer混合液，混勻后室溫靜置10 min，檢測OD值，作為數據2。數據整理按以下公式(Rate表示相對熒光素酶活性):

1.4 數據分析

采用SPSS 15.0軟件進行統計學分析，比率值采用非參數檢驗(Mann-Whitney U)，以P＜0.05為有差異統計學意義。

2 結果

2.1 各類熒光素酶報告基因載體酶切電泳和測序圖

圖1 NK1R巢式PCR擴增啟動子電泳圖Figure 1 NK1R promoters amplified by nested PCR

各類PCR擴增產物和質粒通過1%瓊脂糖凝膠電泳，各條帶均出現在目的位置(見圖1);各類載體及PCR純化產物A260/280均在1.8-2.0。野生型和突變型熒光素酶報告基因載體構建完成后，經測序和酶切鑒定顯示兩類載體構建成功(見圖2 -4)。

2.2 熒光素酶活性檢測

PGL3野生型組和PGL3突變型組熒光素酶相對活性明顯高于PGL3-basic組(P＜0.01);PGL3突變型組低于PGL3野生型組(P＜0.05，見表1)。結果 說明克隆的NK1R基因部分啟動子DNA序列能夠啟動下游基因表達，E-box序列點突變能夠影響該DNA序列的轉錄活性。

圖2 NK1R熒光素酶報告基因載體酶切Figure 2 NK1R luciferase report gene vectors digested by restriction enzyme

圖3 PGL3-basic-NK1R 826 bp熒光素酶報告基因載體部分序列Figure 3 The partial sequences of PGL3-basic-NK1R 826 bp luciferase report gene vector

圖4 點突變型NK1R熒光素酶報告基因載體測序Figure 4 The partial sequences of pGL3-basic-NK1R promoter point-mutated luciferase report gene vector

表1 野生型和突變型報告基因載體相對熒光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

表1 野生型和突變型報告基因載體相對熒光素酶活性(±s)Table 1 The luciferase activity of wild and mutated report gene vectors(±s)

組別 相對熒光素活性PGL3空載組0.38 ±0.05 PGL3 野生型組 0.75 ±0.05 PGL3突變型組0.60 ±0.07

3 討論

在正常乳腺細胞膜提取物中，NK1R-Tr水平非常低，有時甚至難以檢出，有研究表明，乳腺癌細胞P物質過量表達，導致了NK1R-Tr表達水平也上調，具體的中間過程，有可能P物質直接作用，也有可能P物質通過其他細胞因子激活NK1R-Fl表達，總之P物質和NK1R，尤其是NK1R-Tr在乳腺上皮細胞共同高水平表達，暗示細胞惡變［4-6］。通過對NK1R轉錄起始上游序列的分析，發現有幾處E盒結構，鑒于轉錄起始點上游第一和第二個E盒相距較遠，我們選擇性克隆了只含第一個E盒結構的DNA序列，片段大小為826 bp，通過對E盒第5個堿基T置換為C，我們發現含突變E盒的DNA序列對下游熒光素酶基因的轉錄活性有所下降，我們的研究揭示近段第一個E盒結構的完整對下游基因的轉錄活性有一定的影響。

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［6］Bandari PS，Qian J，Oh HS，et al.Crosstalk between neurokinin receptors is relevant to hematopoietic regulation:cloning and characterization of neurokinin-2 promoter［J］.J Neuroimmunol，2003，138(1-2):65-75.