OK-432腫瘤細胞疫苗對荷瘤小鼠B細胞免疫效應的影響

武 峰，馮振明，康 仟，田國兵(山西醫科大學口腔醫院修復科，太原 0000;山東省東營市市直機關醫院口腔科;山西省人民醫院口腔內科;通訊作者，E-mail:tianguobing007@6．com)

腫瘤的發生發展與機體的免疫功能息息相關，當腫瘤發生后，機體可產生針對腫瘤抗原的特異性免疫應答，其中體液免疫發揮著重要的作用，而B淋巴細胞的基本功能是當機體受抗原刺激后參與體液免疫，此外，B細胞還能代替樹突狀細胞作為抗原提呈細胞(APC)參與腫瘤免疫應答［1］。因此本研究利用DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠鱗狀細胞癌荷瘤模型，在此腫瘤模型的基礎上分組并進行藥物干預，通過測定各組小鼠外周血中B淋巴細胞的含量，從而分析OK-432腫瘤細胞疫苗如何激活機體對腫瘤的體液免疫應答，為尋找OK-432腫瘤細胞疫苗可能的作用機制提供實驗理論基礎，同時為鱗狀細胞癌的免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1．1 瘤株和實驗動物

KLN-205細胞株(DBA/2小鼠來源的肺癌細胞)，購自上海愛丁堡生物科技發展有限公司。KLN-205腫瘤細胞在37℃，5%CO2恒溫箱傳代培養，選取培養4代以上活力旺盛的腫瘤細胞作為靶細胞。雌性DBA/2小鼠75只，清潔級，7周齡，約(20±2)g，購自北京維通利華科技有限公司。

1．2 制備疫苗和建立模型

采用Li等［2］的方法，用戊二醛(GA)作為橋連劑將OK-432與KLN-205細胞結合，制成OK-432腫瘤細胞疫苗。參照Bollag［3］的實驗方法并略加改動，采用 7，12－二甲基苯蒽(DMBA)/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠皮膚癌荷瘤模型。

建模具體方法如下:①實驗前準備:在涂DMBA前1 d用脫毛劑處理所有小鼠背部皮膚的相同部位，范圍大小約2 cm×3 cm。注意脫毛劑停留的時間，防止對小鼠背部皮膚造成灼傷。②實驗始發階段:實驗第1，7，14天，將配置好的 DMBA丙酮液(150 μg/200 μl)涂抹于脫去毛發后小鼠暴露的背部皮膚，每只涂抹200 μl。③實驗促癌階段:第5周起，于每周二、周五，在小鼠暴露的背部皮膚的相同部位涂抹0．25%巴豆油丙酮液，每只涂抹200 μl。定時觀察腫瘤發生發展的情況和荷瘤鼠數。④造模時間:造模時間總共為18周。

1．3 實驗分組及B細胞檢測

選取48只長出腫瘤的荷瘤小鼠隨機分為3組:OK-432疫苗組、OK-432組和空白對照組，每組16只。各組小鼠于左側腹腔分別注射濃度為5×105個/100 μl的 OK-432 腫瘤細胞疫苗 100 μl，0．7 KE(OK-432 計量單位)/100 μl的 OK-432 100 μl，PBS液100 μl，每周注射1次，連續注射3周。于末次注射后第1，3，7，14天，每組隨機選擇4只 DBA/2小鼠進行眼球采血，流式細胞術中利用APC熒光素標記抗小鼠CD45R/B220單克隆抗體(購自美國BD公司)檢測小鼠外周血中B細胞含量。

1．4 統計方法

2 結果

末次注射藥物后第 1，3，7，14 天，OK-432 疫苗組小鼠外周血中B淋巴細胞含量變化的總趨勢為:第1天到第3天時上升較平緩;第7天時明顯升高，第14天時較第7天有所降低，且在各個時間點較空白對照組和OK-432組均明顯升高(P＜0．05);OK-432組與空白對照組前3 d差異不明顯(P＞0．05)，第7天和第14天時較空白對照組明顯增高(P＜0．05，見表1、圖1)。

表1 末次給藥后14 d內小鼠外周血中B細胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

表1 末次給藥后14 d內小鼠外周血中B細胞的含量(±s，%)Table 1 The content of B cells in peripheral blood in mice within 14 d after the last administration(±s，%)

與空白對照組相比，*P ＜0．05;與 OK-432組對比，#P ＜0．05

組別 第1天 第3天 第7天 第14天空白對照組 28．78 ±0．81 30．20 ±1．13 30．15 ±1．10 32．77 ±0．70 OK-432 組 29．26 ±1．04 30．32 ±0．84 39．59 ±1．43* 39．65 ±0．74*OK-432 疫苗組 31．90 ±1．65*# 34．04 ±1．09*# 42．80 ±0．65*# 42．30 ±0．97*#

圖1 小鼠外周血中B淋巴細胞含量變化趨勢圖Figure 1 The changes of the content of the B lymphocytes in peripheral blood in mice

3 討論

OK-432(Picibanil)為細菌類非特異性免疫調節劑，已經大量應用于臨床良、惡性腫瘤的治療，并具有良好的安全性，包括口腔癌。KLN-205細胞源于DBA/2小鼠的鱗狀細胞癌細胞系，通過架橋劑戊二醛把KLN-205細胞和OK-432結合形成自體腫瘤細胞疫苗，不僅帶有腫瘤組織所具有的免疫原性和特異性，還具有和正常組織相同的相關白細胞抗原，不會引發機體的免疫排斥反應。OK-432腫瘤疫苗是利用OK-432直接殺傷癌細胞的作用，通過菌體與癌細胞的直接接觸，使腫瘤細胞變性并暴露瘤細胞“隱藏”著的某些抗原決定簇，從而達到增強腫瘤抗原性的目的［2］。

癌癥的發生一般分為始發階段、促癌階段和演化階段。本研究首先利用DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立DBA/2小鼠鱗狀細胞癌荷瘤模型。DMBA是一種多環芳香烴，單獨應用可誘導倉鼠頰囊癌變［4］，也可以誘導大鼠乳腺癌［5］等腫瘤的發生。巴豆油中富含12-O－十四烷酰佛波醇－13－乙酯(TPA)類物質，Fu等［6］研究表明當其作用于皮膚組織會導致皮膚組織中大量的巨噬細胞滲出，出現明顯的炎癥反應，同時伴有活性氧自由基的釋放，在促癌過程中起著重要的作用。因此，DMBA/巴豆油二階段法誘癌過程與人類癌癥的發生發展相似，說明DMBA/巴豆油二階段誘癌法建立的DBA/2小鼠鱗狀細胞癌荷瘤模型是一種較為理想的實驗動物模型，為后續實驗奠定了基礎。

腫瘤的發生發展是與機體的免疫息息相關的。當腫瘤發生以后，機體可針對腫瘤抗原產生特異性的免疫應答，但隨著腫瘤的發生發展，機體的免疫功能就受到抑制［7］。我們采用主動免疫治療，以期增加腫瘤抗原的免疫原性，克服免疫抑制狀態，增強機體免疫功能。總的來說，機體的免疫分為細胞免疫和體液免疫，在本實驗中主要探討體液免疫的作用，B細胞在體液免疫中通過活化為漿細胞，進而分泌抗體來達到保護機體的目的。因此，本實驗在DBA/2小鼠腫瘤模型的基礎上，通過分組藥物干預，測定小鼠外周血中B淋巴細胞從而判斷OK－432腫瘤細胞疫苗的治療作用。

CD45R/B220是小鼠B細胞最常用的表面標記，該抗原的分布具有限制性，主要表達在B細胞(包括前B細胞)上，也有少部分表達于T細胞和單核細胞。B細胞可能通過以下途徑參與腫瘤免疫:(1)B細胞介導的體液免疫:主要通過分泌IgM、IgG、IgG2b等抗體來實現，Li等［8］研究表明，B 細胞分泌的IgG2b抗體對MCA205腫瘤細胞可以產生抗腫瘤作用;(2)作為抗原提呈細胞(APC):B細胞除產生抗體以外還有一個重要的功能——提呈抗原，而且經CD40活化的B細胞對于巨噬細胞和樹突狀細胞所不能有效攝取的可溶性抗原仍能通過內化加工提呈給T細胞［9］。本實驗中OK-432疫苗組在末次注射疫苗后第1、3、7、14天時，外周血中的B細胞含量較空白對照組和OK-432組均有明顯升高(P＜0．05)，說明OK-432腫瘤細胞疫苗能增加B細胞的含量，增強機體的體液免疫應答，且較單獨應用OK-432效果好。

綜上所述，OK-432腫瘤細胞疫苗可以增強機體的體液免疫應答，克服免疫抑制狀態，增強機體免疫功能。但目前OK-432腫瘤細胞疫苗具體的抗腫瘤作用機制仍不明確，這有待于進一步的研究。

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