EPHB6的缺失突變del915-917促進非小細胞肺癌細胞的遷移

于 軍，鐵 茹，張學策，常 盼，趙 鴿，陳寶瑩(西安醫學院第二附屬醫院中心實驗室，西安 7008;西安交通大學醫學院第一附屬醫院麻醉科;第四軍醫大學唐都醫院放射科;通訊作者，E-mail:pclamper@6.com)

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要病理類型［1，2］，而遠端轉移是NSCLC患者的主要死亡原因。受體型酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)在NSCLC 的轉移過程中發揮重要的作用［3，4］。目前，大家最熟悉的與腫瘤轉移表型相關的RTK是表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)及其家族的成員 ERBB2/Her2、ERBB3和 ERBB4。因此，以EGFR為代表的RTKs成為腫瘤分子靶向治療的靶點［3，5］。EPH 是RTKs中最大的一個亞家族。到目前為止，脊椎動物中發現了16種EPH分子，分為EPHA受體1-10(EPHA1-A10)和EPHB受體1-6(EPHB1-B6)［6，7］。EPHB6 受體與其配體 Ephrin相互作用。當與其配體Ephrin相互作用后，EPH受體調控一系列的細胞生物學行為，包括細胞與細胞的相互作用、細胞遷移等［8，9］。EPHB6缺失與晚期的NSCLC和癌癥的進展密切相關［10-16］。有報道顯示，EPHB6高表達是神經母細胞瘤預后良好的標記［10，12］。而且，在轉移的黑色素瘤和具有轉移特性的乳腺癌細胞系中EPHB6的mRNA表達降低［14-16］。在功能上，EPHB6抑制培養的乳腺癌細胞的侵襲、生長和克隆形成［17-18］，調控細胞黏附與遷移［19］。

一些RTKs的表達水平與早期NSCLC的轉移密切相關，多數RTKs的mRNA高表達與NSCLC轉移正相關，而EPHB6高表達與NSCLC的轉移負相關［20］。最近，我們 EPHB6在 NSCLC中甲基化沉默，而且其再激活能夠抑制NSCLC轉移［21］。我們通過測序篩查 EPHB6編碼區的序列，發現了EPHB6 一個新的突變 del915-917［22］，但其功能不明，本研究在肺腺癌細胞系A549中評價EPHB6的缺失突變del915-917的功能。

1 材料和方法

1.1 細胞培養

本研究用到的NSCLC細胞的培養按照以往的方法進行［21］。A549肺腺癌細胞培養于37℃、5%CO2的孵箱中，采用 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，Invitrogen，Carlsbad，CA)培養基。培養基補充10%胎牛血清(fetal calf serum，FCS)、1%的青鏈霉素。HTB56、HTB58細胞于37℃、5%CO2的孵箱中，采用 MEM(Modified Eagle’s medium，Invitrogen，Carlsbad.CA)培養基。補充10%FCS、1%的青鏈霉素、1%的谷氨酰胺、1%的丙酮酸鈉和1%的非必需氨基酸。

1.2 定點突變

將人EPHB6的cDNA編碼區(base 833-3853 NCBI Accession No.NM_004445)克隆進入pcDNA4 To/myc/hisA表達載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。EPHB6的突變采用QuickChange XL定點突變試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。以pcDNA4-EPHB6作為模板，上游引物為:5'-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG，下游引物為:5'-CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT。測序 Big-Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)，在 ABI3730xl自動 DNA測序儀上完成。測序得到的EPHB6編碼區序列與參考序列(GenBank accession No.NM_004445)進行比對，確認序列的正確性。

1.3 細胞轉染和目的基因的表達

采用轉染試劑Nanofectin(PAA，Austria)轉染A549細胞，操作按照說明書進行。pcDNA4(空載體)、野生型EPHB6表達載體(pcDNA4-EPHB6-wt)或突變型EPHB6表達載體與EGFP的表達載體(pcDNA3.1-GFP，表達綠色熒光蛋白 EGFP)共轉染。為了得到穩定轉染的細胞，用700 μg/ml的G418(Sigma，St.Louis，MO，USA)和 400 μg/ml的Zeocin(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)進行篩選。利用流式細胞儀FACS對EGFP表達陽性的細胞進行分選。對得到的穩定轉染細胞采用Western blot對于EPHB6的表達水平進行確認。

1.4 Western blot檢測EPHB6及其突變體的表達

采用Western blot檢測EPHB6及其突變體的表達，參照以往報道的方法進行［21，23］。小鼠抗人EPHB6 單克隆抗體(1 μg/ml，Abnova Corporation，Neihu，Taipei，Taiwan)、兔抗人 β-actin多克隆抗體(40 ng/ml，Sigma，USA)作為一抗，羊抗小鼠或羊抗兔多克隆抗體(Dianova，Hamburg，Germany)作為二抗。

1.5 細胞活力檢測

用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單個細胞懸液，以每孔5×103個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 μl。將培養板移入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養24 h。每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵箱中繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液。每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。

1.6 細胞遷移的檢測

將每孔5×105個A549細胞(懸浮于100 μl含5%FCS的DMEM培養基中)接種在用于細胞遷移檢測的Transwell?小室(濾膜直徑6.5 mm，濾孔的孔徑 6.5 mm，Corning Inc，Corning，NY)的上層。小室的下層加入600 μl含20%FCS的DMEM培養基。孵育(37℃、5%CO2)16 h，采用流式細胞儀對小室下層中的細胞計數。獨立的實驗至少重復3次，每次做3個復孔。

1.7 劃痕實驗

將A549細胞接種于25 ml的細胞培養瓶，接種密度為每瓶350 000個細胞，培養3 d，用10 μl移液器頭在單層融合細胞上面劃痕。更換新鮮的培養基，采用顯微錄像拍攝觀察傷痕的愈合過程。共拍攝觀察 17 h，每間隔 10 min拍攝一次，攝像機(ZEISS light microscope Axiovert 40C)連接于 CCD攝像機(Hamamatsu)。圖像的采集采用HiPic 32圖像處理系統和WASAB軟件(Hamamatsu Imaging Software)，圖像分析采用Image J軟件。獨立的實驗重復3次。

1.8 細胞大小分析

分別將空載體對照、穩定表達野生型、突變性EPHB6的A549細胞接種于預包被膠原的細胞培養瓶。培養5 h，使細胞貼壁，采用顯微錄像拍攝系統觀察細胞。攝像機(ZEISS light microscope Axiovert 40C)連接于CCD攝像機(Hamamatsu)。圖像的采集采用HiPic 32高效圖像控制系統(High Performance Image Control System)和 WASAB軟件(Hamamatsu Imaging Software)。對于細胞大小(μm2)的分析采用Image J軟件，按照以往的報道進行［24］。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 野生型EPHB6和突變體在A549細胞中的穩定表達

為了研究EPHB6突變體的功能，我們分別構建了EPHB6-wt、EPHB6-del915-917表達載體，分別轉染A549肺腺癌細胞，篩選得到穩定表達的細胞。如圖1所示，以β-actin為內參照，采用Western blot的方法檢測EPHB6及其突變體的表達情況，其中A549為沒有經過轉染的細胞，A549-control為轉染空載體pcDNA4的 A549細胞，A549EPHB6-wt和 A549EPHB6-del915-917分別為轉染EPHB6-wt、EPHB6-del915-917表達載體的A549細胞。結果 顯示，EPHB6-del915-917和EPHB6-wt的表達水平穩定。

圖1 野生型和突變型EPHB6在A549細胞中的表達Figure 1 Expression of wild type and mutant EPHB6 in A549 cells

2.2 EPHB6-del915-917促進A549細胞的遷移

細胞遷移實驗采用美國Corning公司生產的細胞轉移培養板(Transwell migration plates)，將待測細胞接種于上下小室之間的膜上，比較穿過 Transwell?小室的細胞數發現:和對照組比較，遷移到下層小室的A549EPHB6-wt和A549EPHB6-del915-917細胞均顯著增多(P＜0.05)。特別是，表達EPHB6突變體的細胞顯著多于表達野生型EPHB6的A549細胞(P ＜0.05，見圖2)。

圖2 突變型EPHB6對A549細胞的遷移的影響Figure 2 Effects of mutant EPHB6 on the migration of A549 cells

為了進一步確認細胞的體外遷移能力，我們進行了劃痕實驗。造成劃痕8 h后，穩定轉染EPHB6-del915-917的A549細胞愈合3%，野生型EPHB6細胞劃痕愈合1.6%，轉染空載體的對照細胞愈合2%(見圖3)。與空載體對照相比，野生型的EPHB6能夠顯著抑制A549細胞的體外劃痕愈合，而穩定轉染EPHB6-del915-917的A549細胞劃痕愈合速度顯著加快(見圖3)。表明 EPHB6突變不僅導致EPHB6抑制劃痕愈合的效應完全消失，而且其突變體具有顯著促進劃痕愈合的效應。

圖3 突變型EPHB6對NSCLC細胞劃痕愈合的影響Figure 3 Effects of mutant EPHB6 on the wound healing of A549 cells

2.3 EPHB6-del915-917不改變 A549細胞的增殖活力，但影響細胞大小

為了明確EPHB6突變是通過何種方式促進細胞遷移，我們進一步檢測了EPHB6突變對于細胞活力與細胞大小的影響。實驗結果顯示，各組細胞的MTT光吸收值無顯著差異(P＞0.05，見圖4)，表明EPHB6突變并不改變細胞的增殖活性(見圖4)，但明顯使細胞變小(P＜0.05，見圖5)。表明EPHB6通過改變細胞的大小，增強其遷移能力。

圖4 突變型EPHB6對A549細胞增殖活性的影響Figure 4 Effects of mutant EPHB6 on the proliferation of A549 cells

圖5 突變型EPHB6對細胞大小的影響Figure 5 Effects of mutant EPHB6 on the size of A549 cells

3 討論

EPH作為受體型酪氨酸蛋白激酶中最大的一個亞家族，其突變在腫瘤當中的發生比較頻繁。EPHB6 的體突變位點以往在結直腸癌［25，26］、肺癌［27］、卵巢癌［28］和神經膠質瘤［26］中以往都有報道，但突變的功能不明。一項大樣本的測序研究發現肺腺癌中有10種EPH基因發生了突變［27］。由于EPH相關細胞信號網絡的復雜性，對于EPH突變的功能性作用及其后果還知之甚少，尤其缺少直接的實驗證據［29］。

我們以前的研究篩查了80例NSCLC患者和3例NSCLC細胞系，首次發現了3個未見報道的EPHB6突變位點［22］。其中，缺失突變 del915-917位于EPHB6酪氨酸激酶結構域與SAM結構域之間。在結直腸癌中也報道此區域有EPHB6的突變發生［25，26］。這些研究均提示，該區域可能與腫瘤的發生、發展密切相關。本研究通過細胞水平實驗發現:EPHB6突變使NSCLC細胞跨膜遷移能力和劃痕愈合能力均顯著增強，表明 EPHB6突變促進NSCLC細胞遷移。該結果首次明確了EPHB6缺失突變del915-917在NSCLC轉移中的功能，且證實該突變位點所在的區域確實與腫瘤轉移有密切關系，這可能成為NSCLC診斷和治療的新靶點。

另外，本研究顯示 EPHB6突變不但造成EPHB6原有的腫瘤轉移抑制效應消失，更重要的是其突變體具有促發腫瘤細胞轉移的作用。其中一種可能的機制為突變體通過“顯性失活”的方式對野生型EPHB6產生抑制效應。另外，突變體還可能激活促細胞遷移的信號通路及其網絡，但這需要進一步的實驗驗證。

總之，NSCLC中多發EPHB6突變，并且EPHB6突變會促進NSCLC細胞遷移。這可能歸因于突變導致的EPHB6原有抗轉移功能的缺失，也可能是突變體具有新的促轉移功能，其確切機制還有待于進一步研究。

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