番茄紅素影響NF-κB表達對脊髓損傷后大鼠神經功能恢復的作用

唐麗娟，陳 勇，楊 拯，李 曉，張 曉(成都醫學院基礎醫學院基礎醫學實驗教學中心，成都 610500;通訊作者，E-mail:yzixjj@163.com)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)所造成的外傷性截癱是最嚴重的外傷之一。據統計，全世界范圍內SCI的發病率大約每年(20-40)/100萬人。隨著現代交通工具使用的增加，臨床上脊柱外傷合并SCI的病例有逐漸增多的趨勢。因此，SCI的病理生理的實驗研究及治療方法的探索受到了更廣泛的關注。研究發現［1］，繼發性脊髓損傷的機制可能是SCI后免疫炎癥反應，其他各種損傷機制均由免疫炎癥反應引起，并有發現減輕SCI后早期炎癥反應可以起到神經保護和功能恢復的作用［2］。因此，在脊髓損傷早期，有效地控制脊髓的繼發性損傷是一個重要的研究方向。

番茄紅素(lycopene，LP)是一種開鏈式的不飽和類胡蘿卜素，具有多種優越的生理功能，有著廣泛的應用前景。實驗研究證實［3］，番茄紅素可通過其高效猝滅單線氧態和清除自由基的能力，減輕大鼠脊髓損傷后的脂質過氧化反應，還可通過多種途徑發揮抗免疫炎癥反應的作用。本實驗采用免疫組織化學染色檢測脊髓損傷模型脊髓組織中NF-κB的表達，以及后肢功能BBB評分，探討番茄紅素治療脊髓損傷后NF-κB表達對神經功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康、清潔級成年SD大鼠36只，雌性(雌性大鼠尿道短，尿道感染、水腫發生概率低，不易形成尿道阻塞，有利于脊髓損傷術后護理，可提高術后大鼠生存率)，體重(230±20)g，由四川大學實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(川)-10-2006。將36只大鼠按Allen法［4］造脊髓損傷模型后采用隨機數據表法分為3組:對照組、甲潑尼龍琥珀酸鈉治療組(MP組)和番茄紅素組，每組12只。每組再隨機按1，3，7 d分成3個亞組，每個時間點4只。

1.2 主要試劑和儀器

6%番茄紅素油樹脂(新疆瑞德萊福生物科技有限公司)，批號:HY1007261;注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(天津藥業焦作有限公司)，批號:10031501;戊巴比妥鈉(德國進口分裝，北京化學試劑公司)，批號:100808;注射用青霉素鈉(瑞陽制藥有限公司)，批號:10013101;NF-κB一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，批號:D-C1-07C14B;兔抗大鼠二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);批號:07E04AJ;自制數字式脊髓損傷動物模型制備儀。

1.3 模型制備

選取正常SD大鼠，采用腹腔注射麻醉1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，首先剪除大鼠胸椎區域毛，而后均勻噴灑碘伏溶液兩倍備皮區域。以T9棘突為中心做背部正中切口，長約2 cm，逐步暴露淺筋膜、肌肉直到椎骨，再用手術刀小心去除T9椎骨上的肌肉。隨后進行椎板切除術，用有齒鑷剝離T9棘突和椎間軟組織，然后用持針器慢慢剝開錐板(切勿損傷硬脊膜)，暴露脊髓，并適當修剪兩側錐板以獲得良好顯露，用自制數字式脊髓損傷動物模型制備儀打擊器制成脊髓損傷模型，打擊強度為10 g×25 mm，打擊后即刻見大鼠雙后肢發生不同程度抽搐，尾巴甩動，隨后完全松弛，標志模型制備成功，然后逐層縫合手術創口。術后立即腹腔注射9 ml/kg氯化鈉溶液，以減輕手術過程中出血導致的血容量減少。為了避免感染，還要進行青霉素腹腔注射，并在此后3 d每天腹腔注射8×104U青霉素。術后保持大鼠籠具清潔，身體干凈，使其自由進食、飲水。并每天在相應時刻對大鼠進行排尿，直至其恢復自主排尿。

1.4 治療方法

對照組造模成功后不給予治療。MP組造模成功后30 min采用腹腔注射首次給藥，其劑量為30 mg/kg甲潑尼龍琥珀酸鈉，此后24 h注射4次甲潑尼龍琥珀酸鈉，每6 h注射5.4 mg/(kg·h)進行。番茄紅素組造模成功后30 min灌胃溶有番茄紅素油樹脂的玉米油2 ml(按20 mg/kg番茄紅素配制)，此后每天灌胃1次。

1.5 評定方法

每組大鼠按1 d、3 d和7 d亞組進行評定。

1.5.1 BBB 評分 于術后1，3，7 d采用 Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分［5］法評估大鼠后肢運動功能恢復情況。觀察者為非本實驗人員，并且對評分標準十分熟悉。評分前應檢查所有實驗動物的膀胱是否充盈，以免因膀胱肌充盈而影響活動。動物應盡量保持在活動范圍的中心區域活動。采用雙人雙盲法觀察其后肢運動情況，聯合考察大鼠后肢各關節活動、后肢的步態和協調功能、運動時爪子的精細運動。取左右兩側肢體評分平均值作為最后得分。

1.5.2 組織學分析 術后1，3，7 d，各組分別取7只大鼠，以1.5%戊巴比妥鈉麻醉后，開胸暴露心臟和升主動脈，將灌注插管經左心室插入升主動脈，固定插管剪開右心房。快速灌注冰生理鹽水沖凈血液至肝臟及鞏膜蒼白為止，立即轉換4%多聚甲醛灌注150-200 ml，其中前1/3快速灌注，后2/3緩慢灌注，至鼠體變硬時停止。原路顯露并仔細咬除T7-T10棘突和椎板，切取1 cm損傷區域脊髓組織，然后進行石蠟包埋，損傷段做橫行切片，片厚5 μm(20 μm)，用于免疫組織化學檢測 NF-κB。

1.5.3 圖像采集與分析 每個免疫組化標本取一張切片，在同等亮度、像素、曝光、對比度等條件下使用Olympus拍照系統用10×40放大倍數，隨機選擇5個視野，對每個指標進行統一圖像拍照。最后用Image-Pro Plus 6.0圖像處理系統計算每個視野的平均光密度值，光密度值越大表示NF-κB表達越高。

1.5.4 統計學分析 用SPSS 17.0統計軟件處理，實驗數據用±s表示，組間比較采用單因素ANOVA進行分析，顯著性水平為α=0.05。

2 結果

2.1 一般情況

大鼠術后蘇醒，靜臥少動，氣息較微，雙后肢運動功能喪失，肌張力降為零，無食欲，不進水，尿失禁或下腹部膨隆，膀胱發生尿潴留，呈現不完全脊髓損傷的表現。術后前3 d，大鼠活動、進食較少，尿潴留比較嚴重，部分伴血尿及腹部脹氣，此后飲食逐漸增加活動逐漸增多。由于實驗期間護理良好，5-7 d后，大部分大鼠能夠基本恢復自主排尿，且傷口未見感染，身體未出現褥瘡，36只大鼠均進入結果分析。

2.2 BBB 評分

術前所有大鼠評分均為21分。術后1，3，7 d，番茄紅素組與對照組相比，BBB評分均明顯增高(P＜0.05)，MP組術后1，7 d評分顯著高于對照組(P＜0.05，見表1)，3 d雖也高于對照組，但差異無統計學意義。

圖1 大鼠造模后1 d，3 d和7 d NF-κB核轉移情況 (免疫組化染色，×400)Figure 1 NF-κB nuclear transfer at 1 d，3 d and 7 d after SCI (immunohistochemical staining，× 400)

表1 脊髓損傷大鼠BBB評分結果 (分)Table 1 Com parison of BBB scores of rats after spinal cord injury (scores)

2.3 NF-κB 檢測結果

術后1 d番茄紅素組的NF-κB表達與對照組NF-κB表達比較(P＜0.001)。術后3 d和7 d MP組和番茄紅素組NF-κB的表達均明顯低于對照組(P ＜0.001，見表2)。對照組 NF-κB 的表達隨時間而增多，7 d最多;MP組和番茄紅素組NF-κB的表達隨時間而減少，7 d最少。對照組可見大量NF-κB陽性表達顆粒，顆粒著色深。MP組和番茄紅素組NF-κB陽性表達顆粒較模型組少，著色較淺(圖1，見第608頁)。

表2 脊髓損傷大鼠NF-κB的變化Table 2 Com parison of expression of NF-κB after spinal cord injury

3 討論

研究發現，免疫炎癥反應對繼發性脊髓損傷有著直接的影響［6］，而炎性細胞因子的表達更是貫穿炎癥反應的始終。炎性細胞因子主要是由機體的免疫細胞分泌，正常情況下，炎癥細胞因子含量極低，但在各種因素刺激如感染、外傷、缺血后其表達可急劇增加，過度表達可導致或加重組織損傷［7］。因此，減輕SCI后的早期炎癥反應是治療脊髓損傷的有效途徑之一。

NF-κB被認為是調控機體炎癥反應的總源頭［8］。正常情況下，NF-κB是普遍存在于真核細胞中的一種快反應轉錄因子，在靜息狀態下與抑制性蛋白IκB結合并以非活性狀態存在于胞質內。經一定的刺激后，IκB磷酸化和隨后的泛素化降解。NF-κB自由易位到細胞核內，與DNA結合，激活反應的靶基因導致各種各樣的炎癥反應，活化后并上調各種炎癥介質，如:TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及氧自由基等一系列物質［9］。近年來許多研究表明，SCI后產生一些氧自由基和細胞因子可刺激神經細胞、微血管內皮細胞和膠質細胞中的NF-κB激活進入胞核并與靶序列結合，調節相關基因的轉錄活性，如ICAM-1、TNF-a、IL-1、IL-6 等，其基因的增強子和啟動子中均含有與NF-κB的結合位點，形成一種正反饋增加損傷區的炎癥反應，增加組織損害程度。因此，在脊髓損傷的早期抑制NF-κB的激活可以減輕免疫炎癥反應，促進損傷后神經功能的再生與修復，加快脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。

番茄紅素(lycopene，LP)是一種開鏈式的不飽和類胡蘿卜素，抗氧化性能是天然類胡蘿卜素中最強的，其抗氧化能力是β-胡蘿卜素的2倍，維生素E的100倍［10］。最早的有關番茄紅素生物活性的報道是在1959年，Ernster和他的同事們發現在輻射后的小鼠腹腔內注射番茄紅素后生存率提高了，并能抵抗細菌的感染。我們在前期的實驗中已經證實，番茄紅素通過其高效猝滅單線氧態和清除自由基的能力，減輕了大鼠脊髓損傷后的脂質過氧化反應［2］。大量研究還顯示，番茄紅素還能通過多種途徑發揮其抗免疫炎癥反應的作用［11，12］。Feng 等［13］發現番茄紅素通過抑制巨噬細胞中ERK，p38MAPK和NF-κB激活來抑制脂多糖(LPS)誘導NO和IL-6的產生，從而減少免疫炎癥反應。研究報道［14］番茄紅素能抑制脂肪組織中 TNF-α、NF-κB、IL-1β、IL-6和 MCP-1等致炎細胞因子和趨化因子的表達，以預防和限制與肥胖有關的疾病。番茄紅素還可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制人大腸癌細胞HT-29細胞的細胞增殖，發揮其抗癌活性［15］。綜上所述，番茄紅素可以通過清除自由基、抑制氧自由基的產生，抑制 IL-1、TNF-α、IL-6等炎性因子的產生和NF-κB的激活，減輕炎癥反應對組織細胞的傷害。

本研究結果顯示，番茄紅素能有效促進大鼠脊髓損傷后運動功能的恢復，番茄紅素組的BBB評分在造模后各時間點均高于同時間點SCI模型組，且差異有顯著性。同時，番茄紅素組NF-κB核轉運在各時間點均明顯少于SCI模型組，在損傷后3 d，各組NF-κB表達量最多。隨著時間的延長，甲潑尼龍琥珀酸鈉治療組和番茄紅素治療組NF-κB的表達明顯降低，且番茄紅素組比表達最少，這表明番茄紅素可通過在SCI后抑制NF-κB激活，減輕炎癥反應脊髓血管及神經細胞等的繼發損傷，起到對神經組織的保護作用，從而有效促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。本實驗為番茄紅素臨床應用提供了理論基礎，它作為新型功能性天然營養素，具有抗氧化和抗炎等多種生物學功能，用于治療脊髓損傷安全、副作用小，有望成為臨床治療SCI的備選藥物之一，但其保護作用的具體機制還不清楚，有必要進一步深入探討和研究。

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