依達拉奉和遠隔缺血后處理對心肌再灌注損傷的保護

李知平，張 曙，李恒昌，林永鋒，謝海輝(廣東省東莞市人民醫院麻醉科，東莞 5308;廣州市第一人民醫院麻醉科;通訊作者，E-mail:lzp3338@63.com)

藥物后處理和遠隔缺血后處理是近年對抗心肌缺血-再灌注損傷的重大發現，其均是在心肌缺血發生后實施，具有補救作用、操作簡單及廉價(遠隔缺血后處理)等優點［1，2］。心肌缺血 -再灌注損傷的機制復雜且尚未完全闡明，現有治療藥物或治療方法比較單一。依達拉奉是一種新型自由基清除劑，以往的動物腦缺血再灌注實驗證明可以減輕腦缺血再灌注損傷，理論上講依達拉奉用于心肌缺血再灌注保護具有很大潛力［3］，所以我們引入依達拉奉后處理和遠隔缺血后處理聯合應用，以探討其機制及是否具有協同作用，為心肌缺血-再灌注損傷尋求更加有效的治療藥物和新的治療途徑。

1 資料與方法

1.1 動物選擇

健康雄性SD大鼠40只，8周齡，體重250-300 g，由中山大學實驗動物中心提供。

1.2 動物分組

采用隨機數字表法，將其分為5組(n=8):假手術組(S組)、缺血再灌注組(I/R組)、依達拉奉后處理組(E組)、遠隔缺血后處理組(P組)、依達拉奉聯合遠隔缺血后處理組(EP組)。

假手術組(S組)開胸，冠狀動脈左前降支(LAD)穿線但不結扎，觀察210 min;缺血再灌注組(I/R組)開胸，結扎LAD 30 min，再灌注180 min;依達拉奉后處理組(E組)開胸，結扎LAD 30 min，在再灌注前1 min經主動脈根部給予依達拉奉3 mg/kg，然后再灌注180 min;遠隔缺血后處理組(P組)開胸，結扎LAD至20 min時，同時用止血帶結扎大鼠雙下肢，LAD結扎至30 min時，同時開放LAD及雙下肢，實施心臟再灌注180 min;依達拉奉聯合遠隔缺血后處理組(EP組)方法同P組，不同的是在同時開放LAD及雙下肢前1 min，經主動脈根部給予依達拉奉3 mg/kg，然后再實施心臟灌注180 min。

1.3 遠隔缺血后處理方法

在大鼠雙后肢中、上1/3部位止血帶結扎，顏色呈絳紫色，多普勒超聲檢查驗證股動脈血流完全停止示肢體缺血成功，10 min后恢復再灌注。

1.4 大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

腹腔注射3%戊巴比妥鈉45 mg/kg，麻醉后仰臥位固定。采用ECGⅡ導聯監測心電圖。氣管切開插管，連接DH.150小型動物呼吸機(浙江大學醫學儀器廠)。經右頸總動脈插導管至左心室，連接BL.420E+生物信號采集與處理系統(四川泰盟科技有限公司)，以監測心臟功能指標。沿鎖骨中線縱行切開皮膚約2 cm，在第3或第4肋間鈍性分離肌層，打開胸腔，剪開心包，在肺動脈圓錐與左心耳之間平左心耳下緣5 mm處行左冠狀動脈前降支穿線，并用硅膠管套線，阻斷時在貼緊硅膠管的上端用止血鉗夾緊線，缺血30 min，ECGⅡ導聯ST段明顯抬高0.1 mV或T波高聳，心肌顏色變暗紅示心肌缺血成功。松開止血鉗，抬高的ST段或高聳的T波快速回落示再灌注成功。S組左冠狀動脈前降支穿線但不結扎。E組再灌注前1 min靜脈注射依達拉奉(批號:86.100205，江蘇先聲藥業有限公司)3 mg/kg;P組心肌缺血20 min時行遠隔缺血后處理，持續10 min;EP組遠隔缺血后處理方法同P組，依達拉奉給藥方法同E組。

1.5 CK-MB、SOD、MDA 測定

CK-MB、SOD、MDA試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。CK-MB測定:再灌注180 min末，各組分別從右心耳取血1 ml，在全自動生化分析儀上測定CK-MB;SOD、MDA測定:再灌注180 min末打開腹腔，從下腔靜脈取血，分離血清，-20℃保存待測，分別采用硫代巴比妥酸法和分光光度計法測定心肌組織MDA含量和SOD活性，具體操作按照試劑盒說明進行。

1.6 心肌梗死面積測定(infarct size，IS%)

實驗結束并抽取動脈血樣后，再次結扎LAD，經頸內靜脈注射1%伊文氏藍溶液2-3 ml。待大鼠口唇和遠端肢體皮膚藍染后，經頸內靜脈注射10%KCl溶液1-2 ml處死大鼠，迅速摘取心臟并在冰鹽水內洗去表面和心室內殘血，沿冠狀溝切除左、右心房，并將右心室剪去。將留存的左心室用食品保鮮膜包裹后放入-20℃冰箱內保存60 min以上。在分析時將留存的大鼠左心室取出，自LAD結扎處水平向心尖方向垂直于左心室縱軸將凍硬的左心室均勻切成4-5片(厚度為1 mm)。采用數碼相機對切片橫截面拍照保存后，置入1%氯化三苯基四氮唑磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中，37℃避光水浴10-15 min。然后將心肌切片放置在10%中性甲醛中固定過夜后，再次對切片橫截面利用數碼相機拍照。對獲得的數碼相片，采用Photoshop CS3 Extended軟件進行測量處理，以計算心肌缺血危險區和梗死區占總橫截面的百分比。將心肌梗死區的百分比數值除以心肌缺血危險區的百分比數值即為IS%值。

1.7 統計學處理

2 結果

與S組相比，其他各組灌注后CK-MB，IS%顯著增加(P＜0.01)，I/R組灌注后SOD活力降低，MDA的水平增高，EP組灌注后SOD活力增加(P＜0.05);與 I/R組相比，E組、P組和 EP組灌注后IS%減小，CK-MB、MDA的水平明顯降低(P＜0.01)，SOD 活力增加(P ＜0.05);EP組與 E 組、P組比較，CK-MB，MDA水平降低，SOD活力增加(P＜0.05)，IS%明顯減小(P ＜0.01，見表1)。

表1 各組大鼠血清生化指標比較(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

表1 各組大鼠血清生化指標比較(n=8，±s)Table 1 Com parison of serum biomarkers among five groups(n=8，±s)

與假手術組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與 I/R 組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與聯合處理組比較，☆P ＜0.05，☆☆P ＜0.01

指標 時間 假手術組 缺血再灌注組 依達拉奉后處理組 遠隔缺血后處理組 聯合處理組CK-MB(IU/L) 灌注前 13.5 ±9.6 13.7 ±8.5 13.9 ±6.8 13.8 ±7.4 13.6 ±8.5灌注后 14.5±10.3 2 659±1 358＊＊ 1 138±612##＊＊☆ 1 215±1 018##＊＊☆ 860±136##＊＊SOD(U/ml) 灌注前 98.6 ±7.5 99.2 ±6.9 98.4 ±7.2 99.8 ±8.3 97.9 ±5.6灌注后 100.1 ±6.8 90.3 ±4.9* 101.2 ±5.3#☆ 103.4 ±6.3#☆ 120.8 ±9.4*##MDA(nmol/ml) 灌注前 1.8 ±0.8 1.7 ±0.9 1.8 ±0.6 1.8 ±0.5 1.7 ±1.1灌注后 1.9 ±0.7 4.5 ±2.1* 2.5 ±0.8##☆ 2.6 ±0.5##☆ 1.7 ±0.6##IS(%) 灌注前 0 0 0 0 0灌注后 0 16.3±0.8＊＊ 8.2 ±0.3＊＊☆☆ 8.8 ±1.2＊＊☆☆ 4.2±1.0＊＊

3 討論

Wang等［4］在大鼠的研究發現，激活 k受體對缺血預處理減少心肌梗死面積和抗心律失常作用均非常重要。Zhang等［5］證實，通過阻斷股動脈造成大鼠下肢短暫缺血實施RIP(遠隔缺血后處理)的心肌保護作用是由k受體介導的。本研究采用結扎左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，該方法是經典的制備心肌缺血再灌注損傷模型的實驗方法［6］。藥物后處理是指在再灌注時通過藥物治療而獲得的保護效應，簡便易行，且同樣具有重要的臨床實用價值。

藥物后處理的保護效應已被既往研究所證史［7］，早在 2005 年 Kerendi等［8］即發現了遠隔缺血后處理對心肌I/RI的保護作用，但是關于遠隔缺血后處理心肌保護作用的機制目前尚未被完全揭示［9］。而且，各研究所采用的遠隔缺血后處理方式也不盡相同［9］。Tamareille 等［10］在心肌 I/RI大鼠證實，于心肌缺血20 min時對大鼠后肢實施10 min的缺血和隨后再灌注能夠顯著降低心肌梗死體積。許亞超等［11］在心肌I/RI大鼠證明，于心肌缺血期對大鼠雙后肢實施10 min的缺血和隨后再灌注亦能產生明顯的心肌保護作用。因此，本實驗參照既往研究［10，11］采用對心肌I/RI具有確切保護作用的后肢缺血10 min和隨后再灌注這一干預方案進行實驗研究。而且，本實驗結果亦表明，遠隔缺血后處理對心肌I/RI具有明確的保護作用，此與既往研究結果相一致［11］。

依達拉奉的保護作用除傳統的抑制花生四烯酸脂氧合酶途徑外［12］，對羥自由基的有效清除可能是其產生強效心肌保護作用并區別于其他自由基清除劑的優勢所在［13］。如果選擇合理的給藥劑量和途徑，依達拉奉藥物后處理可起到接近于缺血后處理組的心肌保護作用，二者過氧化產物的減少近似，本實驗亦得到印證;更從另一方面證明了抑制自由基氧化應激損傷是缺血后處理保護的重要機制，也是缺血后處理與依達拉奉藥物后處理二者保護作用的共同機制。國外也有對急性心肌梗死患者行直接PCI時采用依達拉奉藥物后處理減輕再灌注損傷的隨機、安慰劑對照臨床試驗，顯示依達拉奉是一種有效的再灌注器官保護藥物［14］。MDA是氧自由基攻擊生物膜引發脂質過氧化損傷的標志產物［15］，而SOD的活力反應了機體抗氧化應激的能力。本實驗發現給予缺血后處理與依達拉奉藥物后處理均能明顯降低血清MDA水平并提高SOD的活力，說明機械性后處理與外源性給予依達拉奉藥物后處理均可大大提高機體的抗氧化能力。因而抑制再灌注早期的自由基氧化應激損傷可能是機械性缺血后處理與依達拉奉藥物后處理保護作用的共同機制。

從本實驗的結果來看，依達拉奉后處理組和遠隔缺血后處理都可減輕心肌缺血再灌注損傷，依達拉奉后處理聯合遠隔缺血后處理明顯效果強于兩者單獨應用。

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