Twist在口腔鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與鱗狀細(xì)胞癌上皮間質(zhì)化的關(guān)系

孫昊軒 馮紅超 宋宇峰

1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，貴陽(yáng) 550004；2.貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院，貴陽(yáng) 550002；3.貴州省食品藥品監(jiān)督管理局，貴陽(yáng) 550000

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，由于面部特殊解剖結(jié)構(gòu)與生理功能的影響，因此OSCC易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。上皮間質(zhì)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[1]。研究[2-3]顯示，EMT在胚胎發(fā)育、組織發(fā)生等過(guò)程中起重要作用，并且是腫瘤侵襲周?chē)＝M織發(fā)生轉(zhuǎn)移的必備條件。EMT相關(guān)蛋白Twist是新近發(fā)現(xiàn)的可賦予細(xì)胞遷移能力的轉(zhuǎn)錄因子。為了闡明OSCC中是否存在EMT而導(dǎo)致其易轉(zhuǎn)移的惡性生物學(xué)行為，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和熒光原位雜交的方法對(duì)30例OSCC標(biāo)本中Twist的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)以免疫組織化學(xué)法對(duì)其他EMT相關(guān)蛋白，包括上皮源性標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）和細(xì)胞角蛋白（cytokeratin，CK），間質(zhì)源性標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-cad）進(jìn)行檢測(cè)和分析，以期為OSCC轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)和預(yù)后評(píng)估提供有價(jià)值的資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本選擇 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科2009—2014年手術(shù)切除的組織蠟塊保存完好的OSCC標(biāo)本，要求術(shù)前未采取任何針對(duì)腫瘤的治療措施，如放療、化療等，術(shù)后均經(jīng)常規(guī)病理檢查確診為OSCC。

1.1.2 臨床資料 共選擇OSCC患者30例，男22例，女8例；高分化22例，中低分化8例；無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例；無(wú)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者。另選擇10例正常口腔黏膜組織作對(duì)照。

1.1.3 試劑 小鼠抗人CK單克隆抗體、小鼠抗人波形蛋白單克隆抗體、小鼠抗人N-cad單克隆抗體、小鼠抗人E-cad單克隆抗體及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人Twist單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Twist mRNA原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)SP法 組織蠟塊行厚5 μm的連續(xù)切片，脫蠟水化后，3%去離子過(guò)氧化氫液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波熱處理修復(fù)抗原，正常山羊血清封閉特異性抗原，分別加入Twist（1∶100）、E-cad（1∶100）、N-cad（1∶100）和CK一抗工作液，4 ℃孵育過(guò)夜，加入生物素化二抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封固。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格進(jìn)行。另取一張切片行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色。

1.2.2 原位雜交 原位雜交探針為地高辛標(biāo)記的Twist寡核苷酸探針。Twist mRNA序列：1）5'-AGCAACAGCGAGGAGGAGCCAGACCGGCACCAGCC-3'；2）5'-CGCAAGCGGCGCAGCAGCAGGCGCAGCGCGGGCGG-3'；3）5'-GACGAGCCGGGCAGCCCGGCCCAGGGCAAGCGCGG-3'。操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。通過(guò)不加探針原位雜交用PBS和陰性標(biāo)本作對(duì)照，以排除特異性染色。

1.2.3 結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)及原位雜交每例切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野（放大200倍）拍照。以Imageproplus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行平均光密度（mean optical density，MOD）分析[4]，分析中進(jìn)行了光密度校準(zhǔn)及空間標(biāo)定，按照陽(yáng)性表達(dá)范圍在照片中畫(huà)出測(cè)量區(qū)域，即總面積A，讀取積分光密度（integral optical density，IOD）數(shù)值，作為這張照片的累積光密度值。MOD計(jì)算方法為MOD=IOD/A。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組間光密度的差異根據(jù)組別大小分別采用兩樣本t檢驗(yàn)（若方差不齊，采用t'檢驗(yàn)）或單因素方差分析，數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件完成，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

N-cad陽(yáng)性信號(hào)主要定位于細(xì)胞膜，高表達(dá)于OSCC的癌巢部位，在癌巢周?chē)[狀上皮層內(nèi)無(wú)表達(dá)（圖1A）；Twist陽(yáng)性區(qū)域主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，呈棕黃、棕褐色顆粒，多表達(dá)于多形性結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，少量表達(dá)于上皮形態(tài)的細(xì)胞（圖1B）；E-cad陽(yáng)性信號(hào)主要定位于正常組織細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜（圖1C），在OSCC組織中多表達(dá)于有細(xì)胞極性的鱗狀上皮部分，呈淺淡的點(diǎn)狀分布，多數(shù)癌巢組織無(wú)著色表現(xiàn)；CK主要定位于細(xì)胞質(zhì)（圖1D），與周?chē)＝M織相比，在癌巢部位的表達(dá)相對(duì)較低。Twist mRNA主要定位于細(xì)胞核，棕褐色的顆粒主要分布在癌組織浸潤(rùn)的前緣（圖1E）；正常口腔黏膜組織內(nèi)未見(jiàn)明顯染色。

圖1 免疫組織化學(xué)染色和原位雜交結(jié)果 SP × 20Fig 1 Immunohistochemical staining and in situ hybridization results SP × 20

Twist、Twist mRNA、E-cad、N-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值見(jiàn)表1：在OSCC組織中，Twist和N-cad的表達(dá)明顯高于正常組織，而E-cad及CK的表達(dá)明顯低于正常組織（P<0.05）。

表1 Twist、Twist mRNA、E-cad、N-cad、CK在OSCC與正常組織表達(dá)的MOD值Tab 1 MOD values of Twist, Twist mRNA, E-cad, N-cad and CK between OSCC and normal oral tissues

OSCC組織中Twist mRNA的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系見(jiàn)表2，Twist、E-cad、N-cad、CK的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系見(jiàn)表3。由表2可見(jiàn)，Twist mRNA在OSCC中低分化組，T3、T4組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)量分別高于高分化組，T1、T2組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 OSCC組織中Twist mRNA的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系Tab 2 Relationship of Twist mRNA expression and clinical pathology data in OSCC

表3 OSCC組織中Twist、E-cad、N-cad、CK的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系Tab 3 Relationship among the clinico-pathologic data with the expressions of Twist, E-cad, N-cad, and CK

由表3可見(jiàn)，在OSCC中低分化組，Twist、N-cad 的表達(dá)高于高分化組，E-cad及CK的表達(dá)低于高分化組；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Twist、N-cad的表達(dá)高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，E-cad及CK的表達(dá)低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而Twist、E-cad、N-cad、CK的表達(dá)在不同腫瘤分期中無(wú)明顯差異（P＞0.05）。

3 討論

1982年，Greenburg等[5]提出了EMT的概念。EMT是指在某些特殊的生理或病理?xiàng)l件下，上皮細(xì)胞表型缺失并獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，細(xì)胞的遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)[6]。近年有研究發(fā)現(xiàn)，E-cad可作為獨(dú)立指標(biāo)預(yù)測(cè)OSCC患者的生存結(jié)果[7]，E-cad表達(dá)的變化在EMT過(guò)程中具有至關(guān)重要的作用[8]。E-cad是一種鈣連接蛋白，用于維持正常細(xì)胞間連接的穩(wěn)定性。在上皮細(xì)胞發(fā)生EMT以及癌癥的發(fā)生過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)E-cad表達(dá)的下調(diào)[9]，可以作為癌細(xì)胞失去上皮特性的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。本研究結(jié)果中，E-cad在OSCC組的表達(dá)明顯低于正常組織，提示在OSCC中可能發(fā)生了EMT現(xiàn)象；在中低分化組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯低于高分化組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示OSCC上皮細(xì)胞失去極性且細(xì)胞間的黏附作用不穩(wěn)定，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞從原發(fā)灶中的分離，導(dǎo)致細(xì)胞移動(dòng)力加強(qiáng)。在T1、T2組與T3、T4組的比較中，E-cad的表達(dá)并無(wú)明顯差異，結(jié)合鏡下觀察，在發(fā)生EMT后E-cad仍表達(dá)于腫瘤中的鱗狀上皮部分。由此推測(cè)，不同大小的腫瘤可同時(shí)存在著EMT細(xì)胞和非EMT細(xì)胞。

CK是各種單層上皮、腺上皮以及復(fù)層上皮表達(dá)的一種中間纖維蛋白，具有高度的細(xì)胞和組織特異性，不同組織來(lái)源及不同分化狀態(tài)的上皮細(xì)胞CK的表達(dá)具有一定特異性，CK表達(dá)譜的改變可以作為上皮細(xì)胞分化過(guò)程的標(biāo)志物[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不同的腫瘤分期中（T3、T4組與T1、T2組）均能檢測(cè)到CK表達(dá)，且無(wú)明顯差異，提示在腫瘤大小與浸潤(rùn)程度方面，腫瘤細(xì)胞均出現(xiàn)上皮細(xì)胞表型，與本實(shí)驗(yàn)E-cad所得結(jié)論相同。本研究中，CK主要定位于細(xì)胞質(zhì)，其在OSCC中低分化組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯低于高分化組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示OSCC低分化與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，上皮表型特征的間質(zhì)化趨向增大，說(shuō)明OSCC中發(fā)生了EMT現(xiàn)象并且可能影響患者的預(yù)后。目前的研究對(duì)CK在參與EMT過(guò)程中的機(jī)制尚無(wú)定論，但在易轉(zhuǎn)移和低分化的OSCC患者中均呈現(xiàn)出上皮標(biāo)志物的喪失，證實(shí)了在OSCC中存在著EMT現(xiàn)象。

N-cad是鈣黏蛋白家族的另外一種黏附因子，主要介導(dǎo)間葉細(xì)胞間的動(dòng)態(tài)黏附作用。N-cad通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平啟動(dòng)后，間接作用于E-cad的合成，抑制其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[13]。本研究結(jié)果顯示：不同T分期比較中，T1、T2組MOD值低于T3、T4組，雖然兩組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但腫瘤大小和N-cad的表達(dá)體現(xiàn)出正相關(guān)趨勢(shì)。分析原因，可能是N-cad的高表達(dá)使細(xì)胞賦予了流動(dòng)性，可使癌細(xì)胞脫出上皮結(jié)構(gòu)，使腫瘤的侵襲性加強(qiáng)，與王博等[14]等研究結(jié)果基本一致。N-cad在中低分化組織及出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)較高，而同組的E-cad表達(dá)降低，提示在OSCC中，腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中更多地發(fā)生了鈣黏著蛋白轉(zhuǎn)化（cadherin switch）現(xiàn)象[15-16]。有學(xué)者[17]認(rèn)為，隨著腫瘤大小的增加和發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能也存在著E-cad向N-cad的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。這些結(jié)果均提示，E-cad和N-cad或可作為OSCC浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)E-cad和N-cad可能會(huì)篩選出OSCC患者中的易轉(zhuǎn)移人群。

Twist基因是一種位于常染色體上的編碼堿性螺旋-環(huán)-螺旋的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)組織發(fā)育中的組織重建，并賦予細(xì)胞遷移的能力；Twist基因的過(guò)量表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞表型的惡性轉(zhuǎn)化，可能是某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[18-19]。Satoh等[20]通過(guò)提高Twist的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)E-cad和β-鏈蛋白（β-catenin）呈低表達(dá)狀態(tài)，其肝臟和腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯增加。本實(shí)驗(yàn)原位雜交結(jié)果顯示：Twist mRNA在T3、T4分組中的表達(dá)明顯高于T1、T2組，免疫組織化學(xué)結(jié)果在腫瘤T分期的比較中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Twist mRNA在OSCC中低分化組和有轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組的表達(dá)分別高于高分化組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示在OSCC中Twist mRNA的過(guò)表達(dá)可能是影響腫瘤分化和轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素。因Twist在腫瘤轉(zhuǎn)移階段表達(dá)明顯增強(qiáng)，所以推測(cè)OSCC上皮細(xì)胞往往早期就出現(xiàn)間質(zhì)轉(zhuǎn)化而致淋巴轉(zhuǎn)移；由于侵襲力強(qiáng)、癌細(xì)胞分裂速度加快，出現(xiàn)大量中低分化細(xì)胞。有研究[21]表明，低分化的癌細(xì)胞導(dǎo)致了腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向。本研究的免疫組織化學(xué)結(jié)果中，Twist在OSCC中低分化組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)明顯高于高分化組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，結(jié)合E-cad和N-cad的表達(dá)差異，推測(cè)Twist可能表達(dá)上調(diào)后直接與E-cad的啟動(dòng)子結(jié)合，抑制E-cad的表達(dá)，而Twist與N-cad的表達(dá)呈正相關(guān)，通過(guò)抑制E-cad和促進(jìn)N-cad轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)控EMT的發(fā)生，使上皮細(xì)胞極性和細(xì)胞間黏附能力喪失，而獲得間質(zhì)特性及細(xì)胞移動(dòng)能力，最終發(fā)生侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[22]。Krisanaprakornkit等[23]通過(guò)上調(diào)舌癌小鼠體內(nèi)的Twist基因，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)肺癌轉(zhuǎn)移導(dǎo)致呼吸困難。上調(diào)Twist表達(dá)后與對(duì)照組相比存活率明顯降低，證實(shí)Twist表達(dá)的升高與患者不良預(yù)后有關(guān)；通過(guò)對(duì)人OSCC的研究，提示干擾Twist的表達(dá)是減少OSCC侵襲的潛在治療方法。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Twist和E-cad、N-cad的表達(dá)水平有明顯相關(guān)性，而Twist和CK在表達(dá)變化上無(wú)明顯相關(guān)性；由此推測(cè)，聯(lián)合檢測(cè)Twist、E-cad和N-cad的表達(dá)可能會(huì)更有效地判斷和預(yù)測(cè)OSCC的轉(zhuǎn)移。

OSCC的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多因素共同作用的復(fù)雜病理過(guò)程。本研究結(jié)果證實(shí)，在人OSCC中存在EMT現(xiàn)象；OSCC中Twist可以通過(guò)調(diào)節(jié)E-cad、N-cad及相關(guān)蛋白的變化促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。隨著研究的深入，會(huì)有助于進(jìn)一步闡明Twist對(duì)OSCC惡性生物學(xué)行為的影響，為T(mén)wist靶向治療提供依據(jù)。

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