口腔癌相關成纖維細胞對人淋巴管內皮細胞增殖、遷移、侵襲、成管的影響

陳思源 高攀 常征 宣鳴

1.四川大學華西醫院西藏駐成都辦事處分院口腔科；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院頭頸腫瘤外科（四川大學），成都 610041

淋巴轉移是惡性腫瘤的最致命性因素之一[1]。腫瘤的淋巴管增生，為腫瘤細胞轉移至區域性淋巴結提供了通道[2]。過去的研究[3-5]主要集中在腫瘤誘導淋巴管生成，而癌周的間質細胞是否促進癌周淋巴管生成尚不清楚。本實驗旨在研究口腔癌間質細胞之一的癌相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）及其可能分泌的多種生長因子在淋巴管生成過程中的作用，為腫瘤淋巴管生成及轉移的分子機制研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

高糖DMEM培養基（Hyclone公司，美國），1%打孔液（Amresco公司，美國），3%雙氧水（成都市科龍化工試劑廠），4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）、小鼠抗人平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）單克隆抗體、小鼠抗人廣譜細胞角蛋白（cell keratin，CK）單克隆抗體、兔抗人波形蛋白（vimentin）單克隆抗體、SP免疫組織化學檢測試劑盒、DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），人淋巴管內皮細胞（human lymphatic endothelial cells，HLEC）、內皮細胞培養基（endothelial cell medium，ECM）、牛血漿纖維粘連蛋白（bovine plasma fibronectin，BPF）（Sciencell公司，美國），基質膠（ECM gel）、膠原蛋白Ⅰ型（Sigma公司，美國）、8 μm/0.4 μm孔徑transwell小室（Corning公司，美國）。

二氧化碳恒溫培養箱（Queue公司，美國）、超凈工作臺（Sanyo公司，日本）、倒置相差顯微鏡、Olympus顯微攝像儀（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 分離和培養人CAFs和正常成纖維細胞（normal fibroblasts，NFs） 標本的取得遵守世界醫學會（World Medical Association，WMA）《赫爾辛基宣言》所闡述的原則，經四川大學華西口腔醫學院倫理委員會批準，并獲得患者及其監護人知情同意。標本取自就診于四川大學華西口腔醫院頭頸腫瘤外科，臨床和病理診斷為口腔鱗狀細胞癌且術前未進行放化療的患者。取患者手術后切除的鱗癌組織及癌旁組織（>2 cm），標本新鮮、完整，包括上皮及其鄰近的結締組織。用PBS和抗生素清洗標本，修剪掉上皮和脂肪組織，將剩余結締組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，放入含有高糖DMEM培養基的培養瓶中，培養基中含有20%胎牛血清、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素。37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每2～3 d換液1次。待細胞鋪滿瓶底后，用棉簽刮除成團生長的上皮細胞[6]。0.25%胰蛋白酶消化，用吸管反復輕輕吹打成纖維細胞生長的區域，制備細胞懸液，計數后進行擴大培養。

1.2.2 免疫組織化學染色鑒定CAFs和NFs 將第3代的CAFs和NFs接種于加入蓋玻片的六孔板中培養，待細胞鋪滿60%時進行免疫組織化學染色。4%多聚甲醛固定15 min，打孔液處理20 min，3%雙氧水避光孵育10 min以切斷內源性過氧化物酶，滴加SP的試劑A，室溫孵育10～15 min，分別滴加一抗，以PBS代替一抗作陰性對照，置于濕盒中4 ℃過夜。滴加SP試劑B，37 ℃孵育10～15 min，滴加SP試劑C，37 ℃孵育10～15 min。滴加新鮮配制的DAB溶液（50～100 μL），光鏡下觀察，于反應部位產生棕色沉淀且無明顯背景時終止顯色。

1.2.3 共培養對HLEC增殖能力的影響 用含5%FBS的ECM復蘇HLEC，接種于BPF包被的培養瓶中并擴大培養。0.25%胰酶消化HLEC后，用含5%FBS的ECM制成細胞混懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，接種于24孔孔徑為0.4 μm的transwell小室的下室。用無血清的DMEM培養基將CAFs和NFs的密度調整為每孔1×105個，分別接種于實驗A組（HLEC+CAFs）、實驗B組（HLEC+NFs）的transwell小室的上室，空白對照組中只加入DMEM高糖培養基。間隔48 h在倒置相差顯微鏡下（×100）觀察HLEC，隨機觀察6個不重疊的高倍視野，直至192 h為止。

1.2.4 共培養對HLEC遷移能力的影響 0.25%胰酶消化HLEC后，用含有5%FBS的ECM制成細胞混懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，接種于24孔孔徑為8 μm trenswell小室的上室。用無血清的DMEM培養基將CAFs和NFs的密度調整為每孔1×105個，分別接種于實驗A組、實驗B組的transwell小室的下室，空白對照組中只加入DMEM高糖培養基。培養96 h后用4%多聚甲醛固定濾膜上下表面附著的細胞20 min，用棉簽擦去濾膜上表面的細胞后PBS沖洗3次。在倒置相差顯微鏡下（×100）計數已遷移至濾膜下面的細胞，每個濾膜隨機觀察6個不重疊的高倍視野。

1.2.5 共培養對HLEC侵襲能力的影響 0.25%胰酶消化HLEC后，制成細胞混懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，接種于已鋪好基質膠的24孔孔徑為8 μm trenswell小室的上室。其余步驟同遷移能力實驗。

1.2.6 共培養對HLEC成管能力的影響 將基質膠鋪在24孔孔徑為0.4 μm transwell小室的下室，纖連蛋白包被在基質膠上，置于37 ℃、5%CO2的孵箱中1 h。0.25%胰酶消化HLEC后，用含有5%FBS的ECM制成細胞混懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，接種于transwell小室的下室。待細胞相互融合后，加入0.5 mLⅠ型膠原蛋白。用無血清的DMEM培養基將CAFs和NFs的密度調整為每孔1×105個，分別接種于實驗A組、實驗B組的transwell小室的上室，空白對照組中只加入DMEM高糖培養基。培養24 h后在倒置相差顯微鏡下（×100），隨機觀察6個不重疊的高倍視野，計數成管數目。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 5軟件對數據進行統計分析。計量資料統計結果以均數±標準差表示，實驗多組樣本均數之間的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAFs和NFs的分離和純化

原代細胞培養純化第3代細胞的鏡下表現見圖1。CAFs呈長梭形，胞質突少，細胞大小不一，生長密集，排列無方向性、較雜亂，可見重疊生長、接觸抑制和密度抑制喪失等現象。NFs呈多胞質突的扁平星狀，細胞大小基本一致，排列有一定方向性，鋪滿瓶底后可呈柵欄狀或放射狀外觀，無重疊生長，存在接觸抑制及密度抑制現象。

圖1 組織塊法培養的第3代CAFs和NFs 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 1 The third generation of CAFs and NFs by method of tissue block inverted phase contrast microscope × 100

2.2 CAFs和NFs的鑒定

免疫組織化學染色可見，CAFs中CK陰性表達，波形蛋白和α-SMA陽性表達，胞質呈棕黃色著色（圖2）。NFs中α-SMA和CK陰性表達，波形蛋白陽性表達，胞質呈棕黃色著色（圖3）。

2.3 CAFs、NFs與HLEC共培養促進HLEC的增殖

由HLEC的增殖曲線（圖4）可見，隨著時間推移各組HLEC數目均增加。統計分析表明，培養48 h，各組HLEC數目增加的差異無統計學意義（P＞0.05）；培養96、144、192 h，實驗A組HLEC的數目均多于B組和空白對照組，實驗B組HLEC的數目多于空白對照組（P＜0.01）。CAFs、NFs與HLEC共培養促進了HLEC的增殖，且CAFs的促進作用大于NFs。

圖2 CAFs波形蛋白和α-SMA陽性表達 免疫組織化學 × 100Fig 2 Positive expression of CAFs by vimentin and α-SMA immunohistochemistry × 100

圖3 NFs波形蛋白染色陽性 免疫組織化學 × 100Fig 3 Positive expression of NFs by vimentin immunohistochemistry × 100

圖4 不同共培養體系中HLEC的增殖曲線Fig 4 HLEC proliferation curve in different co-culturing systems

2.4 CAFs、NFs與HLEC共培養促進HLEC的遷移

各組HLEC的遷移情況見圖5。實驗A、B組和空白對照組HLEC遷移至膜下表面每高倍視野下的細胞數分別是（71.0±4.60）、（46.00±5.40）、（26.17±6.08）個，統計分析表明，3組之間的差異均有統計學意義（P＜0.01），實驗A組HLEC的遷移數目多于B組和空白對照組，實驗B組HLEC的遷移數目多于空白對照組。CAFs和NFs增加了HLEC的遷移能力，且HLEC對CAFs的趨化效應強于NFs。

2.5 CAFs、NFs與HLEC共培養促進HLEC的侵襲

各組HLEC的侵襲情況見圖6。實驗A、B組和空白對照組HLEC侵襲至膜下表面每高倍視野下的細胞數分別是（65.0±4.00）、（40.5±3.27）、（18.8±3.87）個，統計分析表明，3組之間的差異均有統計學意義（P＜0.01），實驗A組HLEC的侵襲數目多于B組和空白對照組，實驗B組HLEC的侵襲數目多于空白對照組。CAFs和NFs增加了HLEC的侵襲能力，且CAFs對HLEC的侵襲能力強于NFs。

2.6 CAFs、NFs與HLEC共培養促進HLEC的成管

實驗組HLEC的成管情況見圖7。實驗A、B組和空白對照組的HLEC成管數分別為（25.5±4.81）、（15.7±2.58）、（10.7±2.16）個，統計分析表明，3組之間的差異均有統計學意義（P＜0.01），實驗A組HLEC的成管數目多于B組和空白對照組，實驗B組HLEC的成管數目多于空白對照組。CAFs和NFs增加了HLEC的成管能力，且CAFs對HLEC的成管能力強于NFs。

圖5 各組HLEC的遷移 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 5 The migration of HLEC in each group inverted phase contrast microscope × 100

圖6 各組HLEC的侵襲 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 6 The invasion of HLEC in each group inverted phase contrast microscope × 100

圖7 實驗組HLEC的成管 倒置相差顯微鏡 × 100Fig 7 The tube formation of HLEC in experimental group inverted phase contrast microscope × 100

3 討論

在腫瘤生長的過程中，腫瘤淋巴管生成是淋巴轉移的預先步驟。近年來，研究方向由腫瘤細胞本身分泌的多種生長因子在腫瘤中的表達與腫瘤的淋巴管密度和淋巴結轉移中出現的顯著相關性逐漸轉向腫瘤基質的作用上。目前尚無關于腫瘤間質細胞分泌的生長因子對于口腔鱗癌淋巴管生成和淋巴轉移促進作用的直接研究。本研究最終選取CAFs作為研究對象是由于以下幾個原因。首先，CAFs是腫瘤基質中最主要的調節細胞，腫瘤基質內的成纖維細胞與創傷修復中的成纖維細胞一樣，其表型發生了改變[6]，這種“活化”的成纖維細胞也稱作腫瘤周圍成纖維細胞、腫瘤相關成纖維細胞[7]；其次，原代成纖維細胞的培養技術已趨于成熟[8-10]；最后，CAFs作為腫瘤基質中最主要的宿主細胞之一，通過直接的細胞-細胞接觸、可溶性因子的分泌和細胞外基質修飾對該體系的平衡起著重要的調控作用[11-12]。

本實驗成功地分離培養了口腔癌CAFs和NFs，通過形態學觀察及對某些蛋白表達的檢測初步鑒定了CAFs和NFs；采用transwell小室模型進一步將CAFs、NFs與HLEC共培養，證實了CAFs與NFs均能促進HLEC的增殖、遷移、侵襲和成管，并且CAFs的作用明顯大于NFs（P＜0.05）。這說明CAFs與NFs中都可能有促進淋巴管生長的生長因子的表達，且前者的表達量大于后者。由此可見，腫瘤基質中的CAFs所分泌的某種或某些生長因子在淋巴管生成過程中起重要作用[13]。在今后的研究中，將繼續檢測相關表達上調的基因，對于CAFs可能分泌的生長因子進行定性、定量分析，研究相關的生長因子對于HLEC相關蛋白表達的影響，以及在信號通路水平研究口腔癌相關成纖維細胞對口腔鱗癌淋巴管生成及轉移作用的分子機制，為尋找治療口腔癌淋巴轉移的新靶點奠定基礎。

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