全長型脾酪氨酸激酶在口腔鱗狀細胞癌組織中的表達及其與腫瘤侵襲和轉移的關系

王釗 陳潔 儲偉明 達明杰 馬露 吳敏 鐘旖 王子露 宋曉萌 吳煜農

1.南京醫科大學口腔疾病研究江蘇省重點實驗室；2.南京醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科；3.口腔病理科，南京 210029

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）作為一種口腔頜面部高發的，淋巴結轉移早且以淋巴轉移為主要轉移途徑的惡性腫瘤，在全球范圍內其發病率排第6位，每年新增約60萬病例。近30年來，OSCC的5年生存率無明顯改善，維持在60%[1-2]。為了改善OSCC的預后，很多抑癌基因隨之發現，并用于臨床，取得了較好的臨床效果。脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，SYK）作為一種候選抑癌基因，在多種惡性腫瘤的病理過程中起著極為重要的作用[3-4]。SYK基因在轉錄過程中會選擇性拼接，產生兩種蛋白異構體[5]，即全長型SYK[SYK（L）]和短縮型SYK[SYK（S）]。近年來，有研究[6-7]發現SYK（L）在乳腺癌、肝癌中發揮著抑癌基因的功能，但迄今尚未見其在OSCC組織中表達的相關報道。

本實驗運用實時熒光定量聚合酶鏈反應（realtime quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、免疫印跡（Western blot）、免疫組織化學法檢測SYK（L）在OSCC組織中的表達，初步探討其與OSCC發生以及轉移的關系，為進一步研究SYK（L）在OSCC中的作用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 組織標本

選取江蘇省口腔醫院口腔頜面外科2012—2013年期間OSCC患者27例，其中13例為單純OSCC患者，無頸部淋巴結轉移；14例為OSCC患者伴一側或雙側頸淋巴結轉移，每例患者收集其癌組織和癌旁組織各一份。所有的組織標本及淋巴結轉移均經過手術和病理證實，同時收集正?？谇火つ吮?4例作為正常對照，其中10例來自口腔黏膜良性增生物的正常邊緣，4例來自口腔創傷黏膜組織。每份標本都分成3份，一份進行RNA的提取，一份進行總蛋白的提取，一份運用石蠟切片技術處理。

1.2 SYK（L）特異性抗體定制與檢測

SYK（L）特異性抗體的定制參照文獻[6]，針對SYK（L）特有而SYK（S）缺失的23個氨基酸，合成氨基酸序列TWSAGGIISRIKSYSFPKPGHRKC，經過鑰孔血藍蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）偶聯后免疫新西蘭白兔，提取免疫后陽性血清并與抗原親和純化，得到與抗原特異性結合的抗體（抗體制作由蘇州Abgent生物科技有限公司完成）。

1.3 RT-qPCR引物序列

聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。SYK（L）上游引物序列為：5'-GAATCAAATCATACTCCTTCCCAAA-3'，下游引物序列為：5'-GGCTCATACGGATTGAATGACA-3'。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參，上游引物序列為：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物序列為：5'-GAGATGGTGATGGGATTTC-3'。

1.4 方法

1.4.1 RT-qPCR技術檢測SYK（L）基因的相對表達量 用Trizol法提取組織標本總RNA（Invitrogen公司，美國），紫外分光光度計測定其純度和濃度，并用PrimeScript RT Reagent Kit（TaKaRa公司，日本）試劑盒逆轉錄為cDNA。PCR過程選用FastStart Universal SYBR Green Master（Roche公司，瑞士）試劑盒，在ABI7300HT RT qPCR儀（Applied Biosystems公司，美國）上進行。具體反應體系參照文獻[8]，總體系20 μL，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，退火溫度為60 ℃，共35循環。原始數據值（Ct值）換算為基因的相對表達量，R=2-（ΔCP樣品-ΔCP對照），其中R是SYK（L）相對于內參GAPDH的表達量，ΔCP=CtSYK(L)-CtGAPDH。

1.4.2 Western blot技術檢測SYK（L）蛋白的表達 用RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，定量總蛋白樣品為15 μg并上樣，經7.5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳后，轉移到聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，與相應的一抗4 ℃雜交過夜，磷酸鹽吐溫（phosphate-buffered saline tween，PBST）緩沖液漂洗，室溫下用含辣根過氧化酶標記的二抗（1︰3 000稀釋）室溫孵育1 h，洗膜后與化學發光HRP底物ECL發光液顯影劑結合，經ImageQuant LAS 4000發光成像分析儀曝光并用Image J軟件測定各組SYK（L）與β-actin的灰度值比值作為SYK（L）蛋白的相對表達量。

1.4.3 免疫組織化學染色檢測SYK（L）蛋白的表達組織標本經多聚甲醛溶液固定并脫水包埋，連續5 μm切片。二甲苯脫蠟和乙醇梯度水化后，用PBS沖洗。檸檬酸鈉修復液中微波抗原修復20 min，待切片自然冷卻至室溫后置于3%過氧化氫中10 min，PBS沖洗，即用型正常山羊血清封閉20 min，4 ℃下SYK（L）（1︰300稀釋）一抗孵育過夜。用Polink-2 plus（GBI公司，美國）試劑盒結合一抗，DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術公司）染色3 min，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹脂封片。以β-actin抗體（1︰1 000稀釋，Bioworld公司，美國）染色作為陽性對照，以山羊血清代替一抗作為陰性對照。染色判斷與評分標準參考文獻[9]，由2位病理科醫師分別雙盲閱片。每張切片隨機選取5個包含上皮組織的視野，每個視野計數100個細胞，由陽性細胞所占比例和染色程度綜合評分：陽性細胞<10%為0分，10%～30%為1分，31%～50%為2分，>50%為3分；細胞無顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。每例綜合積分為前述2個評分的乘積。積分≤2評判為陰性表達，>2為陽性表達。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統計分析。用T檢驗分析不同組別SYK（L）基因的相對表達量；用χ2檢驗分析免疫組織化學SYK（L）的表達差別，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SYK（L）在OSCC組織中的表達

RT-qPCR檢測結果見圖1。SYK（L）基因在口腔正常牙齦組織、癌旁組織及癌組織中表達量依次降低，各指標間差異均有統計學意義。

圖1 SYK（L）基因在正常牙齦、癌旁組織、癌組織中的相對表達量Fig 1 Relative expression of SYK(L) mRNA in normal tissues, OSCC tissues and its matched adjacent non-cancerous tissues

Western blot灰度值分析結果見圖2。在14例正?？谇火つ?、27例癌旁組織和對應27例癌組織中，SYK（L）蛋白的相對表達量依次降低，且均有統計學差異，與RT-qPCR結論相一致。同時免疫組織化學結果也顯示（圖3）：SYK（L）在正常組織中強陽性表達，在癌組織中表達降低或缺失。正常牙齦組織中SYK（L）蛋白陽性表達率為71.4%（10/14），癌組織中陽性表達率為29.6%（8/27），差異有統計學意義。對于同一患者，其癌組織和癌旁組織中SYK（L）表達也具有統計學差異（圖4）。

圖2 SYK（L）蛋白在正常牙齦、癌旁組織、癌組織中的表達Fig 2 Expression of SYK(L) protein in normal tissues, OSCC tissues and its matched adjacent non-cancerous tissues

圖3 SYK（L）在不同組織中的表達差異 免疫組織化學Fig 3 Expression of SYK(L) in different tissues immunohistochemistry

2.2 SYK（L）的表達與OSCC淋巴結轉移的關系

由圖5可見，在癌組織及癌旁組織中，轉移組的SYK（L）的相對表達量與癌組織淋巴結轉移的相關關系見圖5。SYK（L）表達量都比對應未轉移組的表達量低，其中SYK（L）蛋白在癌組織中差異具有統計學意義（P=0.01），而在癌旁組織中差異無統計學意義（P>0.05）。

2.3 SYK（L）蛋白表達的定位差異

免疫組織化學檢測結果顯示：正常的牙齦組織中，SYK（L）蛋白在胞漿中均有表達，陽性表達率為100%（14/14），其在胞核中的陽性表達率為64.3%（9/14）；而在癌組織中，SYK（L）蛋白在胞漿中陽性表達率為100%（14/14），但在胞核中的陽性表達率明顯降低，僅為25.9%（7/27），SYK（L）蛋白在胞核中的表達差異具有統計學意義（P=0.017）。

圖5 SYK（L）在癌組織和癌旁組織中的表達差異Fig 5 Relative expression of SYK (L) in OSCC and its matched adjacent non-cancerous tissues

3 討論

OSCC是頭頸部最常見的惡性腫瘤，約占全身惡性腫瘤的3%[10]。近年來口腔癌的發病率逐年增高，且有年輕化、女性化趨勢。治療失敗或局部復發、轉移是口腔癌患者主要死亡原因。雖然經過以手術、放療和化療為主的綜合治療后，口腔癌患者5年生存率達到60%，但晚期患者5年生存率為20%～40%[11]。因此，尋找口腔癌新的治療靶點一直是該領域的研究重點。淋巴轉移是OSCC主要的轉移方式，轉移率為50%～59%，且對預后有著重要影響。OSCC頸淋巴結轉移受諸多因素的影響，其中包括患者的免疫狀態、臨床病理相關因素、轉移相關基因等，但其相關分子機制尚未闡明。

SYK基因最早由日本學者[12]于1991年從豬脾cDNA中克隆出來，該基因位于人染色體9q22，蛋白相對分子質量為72 000，在較長時間內被認為是造血細胞特有的分子，后來發現SYK在多種非造血細胞中也有表達。SYK作為酪氨酸激酶家族成員，其在免疫系統中參與廣泛的信號級聯的網絡調控，隨著細胞類型、底物、受體的不同，能調節多種信號通路。核轉錄因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是近年來研究熱門的核轉錄因子，其在組織損傷、應激、細胞分化、凋亡以及腫瘤微環境中作用廣泛。SYK可以通過磷酸化NF-κB的抑制物IκB來激活核NF-κB信號通路，發揮下游轉錄功效，啟動或者抑制下游靶基因的轉錄功能。Src和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）作為在腫瘤中研究較為深入的酪氨酸激酶，在腫瘤中表達異常增高，介導著腫瘤的發生與發展。而SYK可通過降低Src的活性，干擾EGFR及其下游信號分子的磷酸化來抑制Src和EGFR的信號通路。另外，SYK還可以通過激活磷脂酰肌醇激酶、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路直接或間接影響細胞的生長[13]。

自2000年Coopman等[14]首先發現SYK在乳腺癌細胞中表達下調以來，陸續發現其在肝癌、胃癌、肺癌、黑色素瘤等多種癌細胞中表達下調，推斷SYK可能是一種潛在的抑癌基因[3]。以往關于SYK在頭頸癌中表達的研究甚少，Luangdilok等[8]發現SYK在頭頸部鱗癌（squamous cell carcinoma of the head and neck，SCCHN）細胞中表達上調，且增加了SCCHN細胞的運動性。而Ogane等[15]研究結果卻發現，SYK在OSCC中表達缺失，是潛在的抑癌基因。SYK在SCCHN和OSCC中作用的截然相反是否由組織來源的差異導致的，仍需進一步證實。

更深入的研究發現，SYK在轉錄過程中會選擇性地拼接，產生兩種蛋白異構體，一種為SYK（L），有研究[5-7]發現其發揮著抑癌基因的功能，而選擇性拼接導致IDB域缺失了23個氨基酸的SYK（S）沒有此項功能[16]。SYK（L）與SYK（S）在亞細胞定位上也存在差異，這為更加深入研究SYK在OSCC中的亞型差異提供了結構基礎。

近年來，洪健等[17]關于SYK（S）亞型蛋白的研究顯示，SYK（S）可促進肝癌細胞的侵襲轉移能力，首次提示SYK可能扮演著癌基因的角色，這也顯示出區分SYK不同亞型在研究癌癥發生發展過程中的必要性。本研究將SYK（L）在口腔癌中單獨檢測，結果顯示SYK（L）在OSCC中表達下調，并在轉移和非轉移患者中表達趨勢也不同，表明SYK（L）與OSCC的發生和發展有關。這一結論和既往大部分的報道相一致，驗證了其抑癌基因的作用，同時也為不同結論提出合理的解釋，即SYK“抑癌基因”的角色實際是由SYK（L）亞型擔任，而SYK（S）可能具有癌基因的功能，兩者功能相反，可能是獲得不同結論的原因。本研究還發現SYK（L）在口腔癌中失去核定位能力，這也為SYK（L）在口腔癌中的作用缺失提供了有力證據。

本研究發現SYK（L）的表達缺失是OSCC高淋巴結轉移率和高侵襲性的重要原因，為進一步揭示惡性腫瘤淋巴轉移相關分子機制提供了新思路。目前針對腫瘤的治療除傳統的手術治療、放射治療和化療外，腫瘤的綜合治療，特別是基因治療和免疫治療為腫瘤的治療提供了新途徑。隨著SYK在腫瘤的研究不斷深入及技術的發展，相信可為腫瘤的診斷提供新的科學依據。同時提供基因治療，比如對突變或缺失的SYK基因進行修補，有望成為治療腫瘤新的方法，將SYK基因轉染入免疫細胞及腫瘤細胞，激活更多的免疫細胞發揮抗腫瘤免疫作用并阻止腫瘤細胞的生長與擴散。這就進一步提示，在頭頸部腫瘤中對于SYK的檢測將能進一步促進基因治療的步伐，有極強的臨床意義。

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