泮托拉唑聯合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細胞的保護作用

鐘潔霞

泮托拉唑聯合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細胞的保護作用

鐘潔霞①

目的：觀察泮托拉唑聯合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細胞的保護作用。方法：用不同濃度的乙醇孵育體外培養的人胃黏膜上皮GES-1細胞，于不同的時間段中觀察以建立穩定的胃黏膜損傷模型，將泮托拉唑、楓蓼腸胃康膠囊分別配制成不同濃度，MTT法觀察兩藥單獨及聯用對GES-1細胞的干預。結果：人胃黏膜上皮GES-1細胞在7%的乙醇中孵育3 h細胞抑制率達到40%，是最佳的胃黏膜損傷細胞模型。對GES-1細胞的保護，各濃度泮托拉唑和楓蓼腸胃康膠囊均有一定作用，最佳濃度分別為60 μg/mL和200 μg/mL，兩藥聯用后能夠減少藥物劑量，且可以提高對胃黏膜的保護作用。結論：泮托拉唑與楓蓼腸胃康膠囊聯用后可以提高用藥安全，減少用藥劑量，在低劑量下即可保護損傷的人胃黏膜上皮GES-1細胞，臨床上值得推廣。

泮托拉唑； 楓蓼腸胃康膠囊； 人胃黏膜上皮GES-1細胞； 保護

近年來，由于人們飲食、生活越來越沒規律，尤其是過量乙醇的攝入，導致胃炎、胃潰瘍發病率不斷升高，成了臨床最常見的疾病之一，嚴重影響人們的生活質量[1]。泮托拉唑是第三代質子泵抑制劑（PPI），由于其療效顯著，在臨床上廣泛應用于急性胃黏膜病變、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病的治療，但與此同時，其不良反應亦逐漸增多[2]。相關研究報道，泮托拉唑主要不良反應為腹瀉、惡心、嘔吐、消化不良，甚至存在肌病、血液病、腎病等病例，不良反應與藥物劑量存在關系，尤其是對于肝腎功能不全的患者[3]。楓蓼腸胃康由牛耳楓和辣蓼兩種藥物經過現代工藝提取精制而成，兩者配伍升降復常、苦辛并進、寒溫并用，使胃腸得和，具有除濕化滯、理氣健胃等功效[4]。現代藥理研究表明該藥能夠在胃腸發揮解痙抗炎的作用，有效緩解急慢性胃腸炎癥狀[5]。筆者通過本研究觀察泮托拉唑聯合楓蓼腸胃康膠囊對乙醇損傷的人胃黏膜上皮GES-1細胞（簡稱GES-1細胞）的保護作用，從細胞層面上揭示中西藥聯用對胃黏膜保護可能的機制[6]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 GES-1細胞由上海信裕生物科技有限公司提供。

1.2 主要試劑 泮托拉唑（商品名：泮立蘇，40 mg/片，杭州中美華東制藥有限公司，生產批號：140513；楓蓼腸胃康膠囊（0.37 g/粒，海口奇力制藥股份有限公司，生產批號：131005）；超敏發光液（北京普利萊基因技術有限公司）；PVDF膜（深圳泰能新材料有限公司）；MTT（廣州朗日生物技術有限公司）；培養板、培養瓶等（臺州市黃巖方野科技發展有限公司）；胎牛血清、DMEM高糖培養基（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑為市售分析純。

1.3 主要儀器 酶標分析儀（上海閃譜生物科技有限公司）；超凈工作臺（東莞鵬馳凈化科技有限公司）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（北京冠普佳科技有限公司）；GL-16G-II型高速冷凍離心機（上海雙旭電子有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 GES-1細胞的培養 于標準CO2培養箱中用DMEM高糖培養基（含100 mL/L胎牛血清）常規培養GES-1細胞株2～3 d，約90%滿瓶時傳代。

1.4.2 GES-1細胞損傷模型的建立 將GES-1細胞用含乙醇的培養液（濃度4%～8%）作用2～5 h，造成GES-1細胞損傷，運用MTT法進行檢測，結果最佳細胞模型為細胞抑制率40%左右。

1.4.3 細胞的分組和處理 將實驗細胞分為泮托拉唑組、楓蓼腸胃康膠囊組、泮托拉唑聯合楓蓼腸胃康膠囊組（聯合用藥組）、正常組。處理步驟如下：（1）調整細胞密度為5×103/mL，取對數生長期的細胞，接種入96孔板（按照每孔100 uL），常規放置5% CO2、37 ℃的培養箱培養24 h至細胞貼壁后，吸取上清液，運用PBS洗2次。（2）將完全培養基加入正常組GES-1細胞，將篩選出的乙醇濃度加入其余各組，孵育一定時間后，吸取上清液，運用PBS洗2次。（3）于含不同濃度的藥物培養基100 μL中加入泮托拉唑組、楓蓼腸胃康膠囊組、聯合用藥組GES-1細胞，繼續培養24 h。

1.4.4 細胞活性的檢測 正常組加完全培養基100 μL，泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組分別換上100 μL含不同濃度的泮托拉唑（0、10、20、30、40、50、60、80、100 μg/mL）和楓蓼腸胃康膠囊（0、40、80、120、160、200、240、280、320 μg/mL）的培養液，聯合用藥組換上100 μL按上述濃度配制的兩藥聯用培養液，每組設5個復孔。各組在培養24 h后，分別加入10 μL 5%MTT，繼續培養4 h。吸出培養液，加入100μL DMSO于每個復孔中，振蕩10 min使之溶解。運用MTT比色法，用酶標儀以490 nm為測定波長檢測吸光度值（OD值），計算細胞活性。

1.5 統計學處理 統計軟件采用SPSS 16.0，兩組比較采用SNK法，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞生長情況 正常GES-1細胞在倒置顯微鏡下觀察，細胞之間連接緊密，生長旺盛，中央有圓形核，貼壁呈多邊形或菱形等不規則形狀生長。乙醇損傷后，大量細胞漂浮于細胞液中，只有少許細胞貼壁，細胞間隙隨著乙醇濃度提高或損傷時間增加而變大，連接減少，甚至出現細胞片狀脫落，細胞呈橢圓形或圓形狀，可見空泡變性，胞質濃縮，細胞核固縮，死亡細胞逐漸增多。

2.2 乙醇致GES-1細胞損傷模型的建立 在各個不同的時間段，各種濃度的乙醇均對細胞有損傷，其中細胞抑制率達到40%是運用7%的乙醇孵育3 h，表明該模型是細胞損傷的最佳模型，如圖1所示。

圖1 不同孵育時間和不同濃度乙醇對GES-1細胞的抑制率

2.3 各組細胞活性 MTT法顯示，泮托拉唑組中，細胞增殖在濃度為0～60 μg/mL時呈劑量依賴性，增值活性在80～100 μg/mL仍存在，但效果不如60 μg/mL時明顯，與其他濃度比較差異有統計學意義（P＜0.05），這可能是泮托拉唑劑量過高對細胞產生不良反應，如表1所示。楓蓼腸胃康膠囊組中，細胞增殖在濃度為200 μg/mL的時候最顯著，與其他濃度比較差異有統計學意義（P＜0.05），但細胞增殖開始減弱于劑量高于200 μg/mL時，可能是由于藥物毒性的作用，見表2。聯合用藥組細胞與相應濃度的泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組相比，活性均高，差異均有統計學意義（P＜0.01），見表3。

3 討論

GES-1細胞來源于胎兒胃黏膜上皮，具有正常人體胃黏膜上皮細胞多種特點，本實驗選用該細胞作為細胞模型進行體外實驗，在分子水平上接近臨床實驗[7]。實驗采用乙醇誘導胃潰瘍模型潰瘍發生率高，不用手術，方法簡單，結果可靠[8]。本實驗MTT法顯示細胞抑制率達40%在7%的乙醇孵育3 h的條件下

實現，成功造成胃黏膜細胞損傷模型[9]。

表1 不同濃度泮托拉唑與正常組細胞OD值（±s，n=5）

表1 不同濃度泮托拉唑與正常組細胞OD值（±s，n=5）

*與本組其他濃度比較，P＜0.05

組別OD值正常組1.141±0.111泮托拉唑組0 μg/mL0.641±0.09 10 μg/mL0.759±0.05 20 μg/mL0.778±0.04 30 μg/mL0.851±0.20 40 μg/mL0.881±0.06 50 μg/mL0.971±0.05 60 μg/mL 1.068±0.08*80 μg/mL0.987±0.03 100 μg/mL0.974±0.12

表2 不同濃度楓蓼腸胃康膠囊與正常組細胞OD值（±s，n=5）

表2 不同濃度楓蓼腸胃康膠囊與正常組細胞OD值（±s，n=5）

*與本組其他濃度比較，P＜0.05

組別OD值正常組1.141±0.111楓蓼腸胃康膠囊組0 μg/mL0.658±0.059 40 μg/mL0.731±0.063 80 μg/mL0.771±0.091 120 μg/mL0.921±0.051 160 μg/mL0.952±0.069 200 μg/mL 0.969±0.074*240 μg/mL0.931±0.029 280 μg/mL0.874±0.059 320 μg/mL0.837±0.079

表3 不同濃度聯合用藥與正常組細胞OD值（±s，n=5）

表3 不同濃度聯合用藥與正常組細胞OD值（±s，n=5）

*與表1、2中泮托拉唑組和楓蓼腸胃康膠囊組對應濃度比較，P＜0.01

組別OD值正常組1.141±0.111泮托拉唑組聯合楓蓼腸胃康膠囊組0+0（μg/mL）0.675±0.064 10+40（μg/mL） 0.831±0.061*20+80（μg/mL） 0.911±0.072*30+120（μg/mL） 0.952±0.731*40+160（μg/mL） 1.043±0.081*50+200（μg/mL） 1.004±0.105*60+240（μg/mL） 0.891±0.044*80+280（μg/mL） 0.861±0.059*100+320（μg/mL） 0.841±0.043*

現代藥理學研究表明，楓蓼腸胃康膠囊具有顯著的抗炎鎮痛雙重作用，可迅速緩解腹瀉、腹痛、腹脹等臨床癥狀，是治療胃腸道疾病的有效中成藥制劑[10]。泮托拉唑在臨床應用上有著其他藥不可替代的特點，療效顯著，但隨著該藥的廣泛應用，其不良反應也不斷增多，其不良反應涉及包括循環系統、中樞神經系統、消化系統及血液系統等在內的多個器官系統[11-15]。所以，加強對泮托拉唑應用療程及劑量等研究，輔以中藥、中成藥聯用，減少和避免不良反應的發生，具有重要意義。

本實驗將胃潰瘍模型的GES-1細胞利用泮托拉唑和楓蓼腸胃康膠囊單獨以及聯合應用作用，結果表明兩組藥物均有促進增殖的作用，但隨著藥物劑量的遞增，達到一定程度后對細胞的增殖呈抑制作用。聯合用藥可以產生協同作用，在減少用藥劑量的情況下達到相同的效果，達到減量而增效，保證用藥安全。

由于實驗條件的限制，本實驗無法對胃黏膜bFGF蛋白表達進行分析，對中西藥聯用保護胃黏膜細胞的機制有待進一步研究。

[1]唐衛軍.奧美拉哇、蘭索拉哇和伴托拉哇治療胃炎胃潰瘍的療效[J].中國醫學創新，2013，10（10）：132-133.

[2]寧強.泮托拉唑治療消化性潰瘍出血的臨床觀察[J].中國醫學創新，2012，9（2）：38-39.

[3]向竹枝，吳方建.泮托拉唑不良反應34例文獻分析[J].藥物流行病學雜志，2014，23（4）：59-60.

[4]雷招寶，雷光元.泮托拉唑的不良反應與合理應用[J].藥物流行病學雜志，2010，19（3）：170-173.

[5]王蘭君.楓蓼腸胃康膠囊治療急性胃腸炎的有效性及安全性[J]. 2012，34（7）：1232-1234.

[6]李丹，顧志堅.楓蓼腸胃康膠囊聯合曲美布汀與單劑曲美布汀治療腹瀉型腸易激綜合征療效比較[J].湖北中醫雜志，2013，35（1）：17-18.

[7]黃宣，呂賓，趙敏，等.溫郁金二萜類化合物C對幽門螺桿菌誘導人胃GES-1上皮細胞炎癥的抑制作用及其對NF-κB信號通道的影響[J].中國藥理學通報，2013，29（4）：562-567.

[8]秦延，張志廣，李熳.塞來昔布對體外幽門螺桿菌誘導GES-1轉化細胞抑制作用的研究[J].天津醫藥，2013，41（2）：130-132.

[9]李莉，龔曉娟，楊以阜，等.5個制酸類中藥對乙醇大鼠胃潰瘍模型潰瘍指數、NO的影響[J].湖北中醫雜志，2012，34（12）：3-5.

[10]周軍英.楓蓼腸胃康顆粒聯合常規療法治療小兒秋季腹瀉臨床研究[J].新中醫，2014，46（9）：126-127.

[11]鐘華玉，梁健，范元.楓蓼腸胃康膠囊治療腸激惹綜合征臨床觀察[J].黑龍江醫藥科學，2013，36（1）：43-44.

[12]劉洪武，陸萍.奧美拉唑和泮托拉唑治療消化性潰瘍的臨床療效對比分析[J].中國醫學創新，2012，9（14）：35-36.

[13]項迎春，徐旭東.泮托拉唑致不良反應96例文獻分析[J].中國藥房，2008，19（11）：863-864.

[14]孫忠，董佃良，高曉光，等.泮托拉唑的不良反應[J].中國醫藥指南，2012，10（16）：70-71.

[15]鄒檢名，黃暢.泮托拉唑所致不良反應及與其他藥物相互作用特點分析[J].中國醫藥科學，2012，2（16）：69-72.

Protection of Pantoprazole with Fengliao Changweikang Capsule on Ethanol Damage Human Gastric Epithelial GES-1 Cells Injured by Ethanol/

ZHONG J ie-xia.//Medical Innovation of China，2015，12（08）：004-006

Objective：To Observe the protective effect of pantoprazole capsules with fengliao changweikang on human gastric epithelial GES-1 cells injured ethanol. Method： Human gastric epithelial GES-1 cells were cultured in vitro，incubated with different concentrations of ethanol，and observed at different time periods in order to establish a stable gastric mucosal injury model. Pantoprazole and fengliao changweikang capsules were formulated into different concentrations， MTT were used to observe the GES-1 cells intervention by two drugs alone and in combination.Result：Incubated at 7% ethanol for 3 h， human gastric epithelial GES-1 cells inhibition rate reached 40%， and this was the best model of injured gastric mucosal cell.Each concentration of pantoprazole and fengliao changweikang capsules had a protective effect on the GES-1 cells， the optimum concentration of both drugs were 60 μg/mL and 200 μg/mL， in combination with two drugs could reduce the dose and enhance the protective effect of the gastric mucosa. Conclusion：Combining with pantoprazole and fengliao changweikang capsules can improve medication safety， reduce the dosage， protect human gastric epithelial damage GES-1 cells at low doses，and they are worth promoting in clinical.

Pantoprazole； Fengliao changweikang capsule； Human gastric epithelial GES-1 cells；Protection

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.08.002

2014-11-12） （本文編輯：周亞杰）

①廣東省江門市人民醫院 廣東 江門 529000

鐘潔霞

First-author’s address：The People’s Hospital of J iangmen，J iangmen 529000，China