超聲波處理對酪蛋白結構特性的影響

馮景麗 ，賈峰，王金水，高蕓芳，周曉配，李小偉

（河南工業大學a.生物工程學院；b.糧油食品學院，鄭州450001）

0 引言

超聲波是指頻率大于20 kHz的聲波，在液體介質中傳播時會產生“空化效應”，從而影響或改變物質的狀態、性質及結構[1-2]。酪蛋白是一種含磷的酸性蛋白，分子量約為20～25 ku，空間結構由單體αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白通過αs-螺旋、β-折疊和β-轉角等構成。酪蛋白在人體內不易被消化，易過敏，這限制了其在食品領域的使用。高蕓芳等利用超聲波處理酪蛋白研究了水解度(DH)、酶解產物中可溶性氮、氨基氮及肽氮含量的變化規律，但對超聲波對酪蛋白的表面結構和空間構象影響的研究較少[3]。本研究以超聲波處理對酪蛋白結構的影響為切入點，期望為制備生物活性肽，呈味肽等新產品提供新技術方法，提高和改善酪蛋白的功能特性及拓寬其應用領域。

1 實驗

1.1 材料

酪蛋白(蛋白質量分數82.84%，水分11.96%，灰分2.48%)。

JY92-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機，LC1260高效液相色譜儀，Quanta200掃描電子顯微鏡，BT-9300H激光粒度分布儀，WQF-510傅里葉紅外光譜儀。

1.2 方法

1.2.1 超聲波處理酪蛋白

在室溫條件下，量取100 mL去離子水置于500 mL的燒杯中，調整磁力攪拌器轉速為300 r/min。然后準確稱量5.0 g酪蛋白，邊攪拌邊緩慢加入燒杯中，待酪蛋白完全加完后繼續攪拌5 min使形成5%酪蛋白懸浮液，調節至pH=8使其溶解，將酪蛋白懸浮液置于超聲波細胞粉碎(25 kHz)機中，調整超聲波的輸出功率分別為160 W和400 W，設置超聲波處理時間為1 h，未經超聲波處理酪蛋白懸浮液為對照。處理之后的懸浮液直接進行粒度分布的測定。處理之后的懸浮液進行冷凍干燥的樣品分別用于表面結構測定、二級結構測定和分子量分布測定。

1.2.2 蛋白表面結構測定

采用掃描電子顯微鏡觀測酪蛋白及超聲波處理的酪蛋白樣品的表面結構。具體步驟如下：將微量的冷凍干燥后的樣品置于樣品臺，經離子濺射儀真空干燥、金粉噴鍍后，調節電鏡加速電壓為20 kV，對樣品進行觀測攝圖。

1.2.3 蛋白的粒度分布測定

粒度分布采用激光粒度分布儀進行測定，樣品為酪蛋白懸液(pH=8)及其酶解液，介質為蒸餾水，介質折射率為1.361，設置物質折射率為1.52，測定時以蒸餾水為背景，加入樣品至遮光率于10%～20%后，進行信息采集，每個樣品平行采集3次，取平均圖譜。

1.2.4 蛋白的二級結構測定

采用傅里葉紅外光譜（FTIR）測定超聲波處理酪蛋白的二級結構。具體步驟如下：稱取固體樣品2 mg，加入200 mg溴化鉀充分研磨干燥，壓片，使用傅里變換葉紅外光譜儀進行4 000～400 cm-1波數掃描[4]。選取波數為1 600～1 700 cm-1波譜圖做傅里葉去卷積和二階導數圖譜，采用Gauss函數進行多次擬合至殘差最小。

1.2.5 蛋白的分子量分布測定

采用高效體積排阻色譜(HPSEC)檢測超聲波處理酪蛋白的分子量分布情況。稱取固體樣品，溶于10%的乙腈，使樣品的最終質量濃度為0.1 g/L。色譜條件如下，流動相為10%乙腈，柱子：Agilent PL aquagel-OH MIXED-H(8 μm，300× 7.5 I.D.)，柱溫為30 °C，流速為0.5 mL/min，進樣10 μL，檢測為214 nm，流動相及樣品溶液均過0.45 μm纖維素酯薄膜。

1.2.6 數據處理

各實驗重復3次，結果以平均值±標準偏差表示。數據在P＜0.05水平上的顯著性采用SPSS 13.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理對酪蛋白表面結構的影響

由圖1（a）（b）可以看出，酪蛋白形成一個大塊，呈層疊狀，組織結構致密，中間沒有明顯的空隙；經160 W超聲波處理1 h后的酪蛋白，結構有了較大的變化，酪蛋白呈層片狀，表面平整，有較明顯的“撕裂狀”，且有“孔洞”出現（圖1（c）（d））；經400 W超聲波處理1 h后的酪蛋白結構變化更加明顯，表面的層片狀結構變小，呈“鋸齒狀”，層片中間有較多的“孔洞”出現（圖1（e）（f））。表明超聲波處理能夠有效地打破酪蛋白的膠團表面結構，使其經過層片化和“孔洞”化，逐步破碎，在相同的處理時間，隨著超聲波功率的增大對于酪蛋白的破碎效果逐漸明顯。

圖1 酪蛋白表面結構

2.2 超聲波處理對酪蛋白懸液粒度分布的影響

由圖2酪蛋白粒徑分布可以看出，當溶液pH值為8時，未處理的酪蛋白粒徑分布范圍較寬，約為0.2～70.0 μm，主要的粒度在0.8～10.0 μm之間，但在10.0～70.0 μm之間的分布也有一個小高峰；經160 W和400 W超聲波處理后的酪蛋白粒度的分布明顯變窄，約為0.2～30.0 μm，主要的粒度在0.6～6.0 μm之間，且分布曲線呈雙峰（0.7 μm和6.0 μm處）模式，經160 W超聲波處理后的酪蛋白在6.0 μm處的峰稍微下陷，而在20.0 μm處的另有一峰；經400 W超聲波處理后的酪蛋白雙峰特征明顯，而在20.0 μm處的未出現峰。表明經過超聲波處理之后酪蛋白的粒度分布發生了變化，隨著處理功率的增加，粒度分布更加均勻，約為0.6 μm，但也可以看出，超聲波處理酪蛋白不能夠是其小于0.2 μm的粒度增加，說明，如果需要更加細小的酪蛋白，超聲波處理的效果可能不好。

圖2 超聲波處理對酪蛋白粒度分布的影響

從圖2酪蛋白粒徑分布累積含量圖，并結合表1數據可知，160 W和400 W超聲波處理1 h后，pH值為8酪蛋白懸液中粒徑在0.2～70.0 μm之間的分布比對照的粒度更加細，但是160 W與400 W超聲波處理1 h后的粒度分布來看，差異不大；表明超聲波處理能夠減小酪蛋白粒徑，對比大功率和小功率超聲波處理之后的粒度分布來看，大功率的超聲波對酪蛋白膠團的“破碎”作用效果不明顯。超聲波對蛋白質粒徑的影響已有報道，Gordon利用高強度超聲波研究超聲時間、溫度、溶液濃度對乳清分離蛋白粒度分布的影響發現，適當的超聲條件能夠降低乳清分離蛋白的粒徑[5]。Arzeni發現，超聲波處理對蛋白粒度分布的作用因蛋白種類而不同，如經高強度超聲處理后，乳清濃縮蛋白及大豆分離蛋白的粒徑減小，而卵清蛋白則升高[1]。

圖3 超聲波處理對酪蛋白粒度分布累積含量的影響

表1 超聲波處理對酪蛋白粒度分布指標的影響

2.3 超聲波處理對酪蛋白二級結構的影響

酪蛋白經超聲波處理之后的傅里葉變換紅外光譜檢測結果如圖4所示。經超聲波處理之后與對照相比，主要在2 000 cm-1和2 400 cm-1處有明顯的吸收峰和吸收谷存在。傅里葉變換紅外光譜屬于振動光譜，具有高通量、高信噪比、高靈敏度、樣品用量少等優點，當一定頻率的紅外光照射被測樣品時，樣品中某些組分會吸收能量而發生振動能級的躍遷，不同組分的能量吸收特性不同，從而產生不同的譜峰，通過分析譜峰特點可以預測樣品結構特性。但是，對于蛋白質和多肽二級結構預測主要集中在酰胺Ⅰ帶（波數1 700～1 600 cm-1）、酰胺Ⅱ帶（1 600～1 500 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 330～1 220 cm-1）上，酰胺Ⅰ帶較寬，主要為酰胺C=O伸縮振動模式，酰胺Ⅱ帶為酰胺C-N伸縮振動及N-H振動。對蛋白質二級結構分析和應用最為廣泛的是對酰胺Ⅰ帶進行去卷積、二階導數擬合處理，且認為 1 610～1 640 cm-1為β-折疊，1 640～1 650 cm-1為無規則卷曲，1 650～1 658 cm-1為α-螺旋，1660～1700 cm-1為β-轉角。

對未經超聲波和超聲波處理后的酪蛋白的紅外光譜酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)進行去卷積、二階導數擬合處理結果如圖5所示，對照酪蛋白得到6個二級結構子峰（圖5a），經過超聲波處理的照酪蛋白分別得到7個二級結構子峰（圖5b和圖5c）。分別把對照和處理的二級結構進行合并結果如表2。由表2可知：酪蛋白二級結構含量分別為α-螺旋22.3%、β-折疊32.26%、β-轉角25.19%、無規則卷曲18.47%。酪蛋白經160 W與400 W超聲波處理1 h后，各種二級結構含量發生不同程度的變化，α-螺旋、β-折疊含量均減少，β-轉角含量明顯增大，經160 W和400 W超聲處理后，酪蛋白中α-螺旋含量由原來的22.53%分別下降為10.73%和13.29%，β-轉角含量由原來的25.19%分別增大為52.04%和49.39%。Raza研究的結果表明，酪蛋白酰胺Ⅰ帶擬合α-螺旋25%，β-折疊30%，β-轉角36%，無規則卷曲9%。與本檢測酪蛋白中的α-螺旋和β-折疊比例相近，而β-轉角和無規則卷曲相差較大，可能與材料的純度差異有關[6]。

另外，α-螺旋與β-折疊含量比值可以在一定程度上表征蛋白質內部結構的柔韌性，α-螺旋/β-折疊數值越小，蛋白柔韌性越大。表2顯示，酪蛋白經超聲波處理后，α-螺旋/β-折疊由0.70下降到0.46，表明經超聲波處理后酪蛋白柔韌性增大。蛋白質二級結構的構成會對其高級結構有一定影響，酪蛋白掃描電鏡結果顯示為超聲波處理后酪蛋白結構疏松，經160 W超聲處理后的酪蛋白呈現“撕裂狀”且表面有孔狀結構，經400 W超聲處理后的酪蛋白則呈現“鋸齒狀”。

圖4 超聲波處理前后酪蛋白傅里葉紅外光譜對比結果

再者，酪蛋白中有較高含量的脯氨酸（Pro），而Pro殘基為中心的轉角與β-折疊基團組成的剛性區域受到一些彈性基團(α-螺旋)的束縛，這些彈性基團使得酪蛋白膠團處于具有一種張力與壓力流變平衡的狀態，因而使得酪蛋白表現為球形結構；超聲波處理使得得以維系酪蛋白穩定球形結構的彈性基團含量減少，致使酪蛋白柔韌性增加，易于形成片層結構。

圖5 酪蛋白的紅外光譜酰胺I擬合圖

表2 超聲波處理對酪蛋白二級結構的影響

張海華等研究了超聲波處理對小麥面筋蛋白的影響，結果發現經超聲波處理后α-螺旋含量減少，而β-折疊與β-轉角含量增多[7]。另外，超聲波處理時形成的“空穴作用”及伴隨著溫度的升高，對蛋白質二級結構的破壞作用也比較明顯，容易造成二級結構間的相互轉化。

2.4 超聲波處理對酪蛋白分子量分布的影響

以未經超聲波處理的酪蛋白為對照，分別以160 W和400 W超聲波處理酪蛋白懸液1 h后冷凍干燥為固體粉末，采用HPSEC檢測酪蛋白的分子量分布，結果表3所示。由表3可以看出，酪蛋白中分子量比較集中的范圍為30 000～40 000 u，其次為20 000～30 000 u。相比于對照酪蛋白，經160 W和400 W超聲波處理1 h后，分子量范圍為30 000～40 000 u與40 000～45 000 u的多肽含量有所下降，且較小分子量范圍多肽含量增加，表明超聲波處理使得酪蛋白中某些大分子量多肽發生了分解。

表3 酪蛋白分子量分布 %

3 結論

采用超聲波處理蛋白酶能夠對使酪蛋白的表面致密的結構發生層片化和孔洞化變化，在較大的酪蛋白顆粒的粒度變小與分子量分布的檢測結果相一致，酪蛋白的二級結構α-螺旋、β-折疊和無規則卷曲減少，即減少分子中的彈性結構，而β-轉角的含量增加；同時，超聲波作用削弱了酪蛋白分子間的作用力，使得酪蛋白原先致密的結構變得相對松散，增加了比表面積，有利于后續的酶解和處理。

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[3]高蕓芳,王金水,蘇銀杰.超聲波處理對酪蛋白-胰蛋白酶體系酶解特性的影響[J].河南工業大學學報:自然科學版,2012,33(5):11-14.

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[7]張海華,朱科學,周惠明.超聲波對小麥面筋蛋白結構的影響[J].中國農業科學,2010,43(22):4687-4693.