不同乳酸菌抗氧化能力的比較與分析

劉少敏 ，周文琦，李婷，滿朝新，郭鸰，姜毓君，

（東北農業大學a.食品學院乳品科學教育部重點實驗室；b.黑龍江省乳品工業技術開發中心，哈爾濱150030）

0 引言

氧化應激是導致機體衰老和與衰老相關疾病的根本原因[1,2]，不僅如此，它還可能引起多種疾病，如動脈粥樣硬化、高血脂、糖尿病、關節炎、神經退行性疾病、心腦血管疾病等[3,4]。因此，對氧化應激的防治成為近年來的研究熱點。大量研究表明，乳酸菌具有多種益生功能，不僅能夠調節機體的免疫系統，維持腸道菌群平衡，還具有一定的抗氧化能力，能夠清除腸道內的活性氧分子，使機體內活性氧分子保持在相對穩定的狀態[5-7]。

本研究選取三株乳酸菌作為研究對象，分別是目前研究最為廣泛的嗜酸乳桿菌NCFM（Lactobacillus aci?dophilus NCFM）、植物乳桿菌植物亞種模式菌株——植 物 乳 桿 菌 ATCC 14917（Lactobacillus plantarum ATCC 14917）、從內蒙古通遼地區傳統發酵乳制品中分離而來、具有多種益生功能的植物乳桿菌NDC 75017（Lactobacillus plantarum NDC 75017），對三株乳酸菌清除自由基的能力進行了比較，并分析和比較其對受到氧化損傷的Caco-2細胞胞內抗氧化酶活性的影響，初步探究了乳酸菌抗氧化作用的機制。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養

菌株來源：嗜酸乳桿菌NCFM、植物乳桿菌ATCC 14917、植物乳桿菌NDC 75017均為東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室保藏菌株。

三株乳酸菌均培養于MRS培養基，37℃培養12 h，傳3代后即為實驗菌株。6 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清液即為實驗所需發酵液；離心后的菌體用無菌PBS洗滌三次，6 000 r/min，4℃離心10 min，即為實驗所需菌體；將菌體在沸水浴中處理20 min，無菌PBS洗滌3次，6 000 r/min，4 ℃離心10 min，即為滅活菌體。

1.2 細胞培養

Caco-2細胞購自于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。Caco-2細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、質量濃度100 μg/mL鏈霉素，質量分數1%非必需氨基酸的高糖DMEM培養液中，在37℃質量分數為5%的CO2條件下培養。

1.3 清除自由基實驗

1.3.1 羥自由基清除實驗[8]

將1 mL的鄰二氮菲（濃度0.75 mmol/L）、2 mL的PBS（pH=7.4）和1mL的FeSO4（濃度0.75 mmol/L）混合均勻，加入1 mL的H2O2（質量分數0.12%）后分別加入三株乳酸菌菌液及其發酵液，混合均勻后37℃靜置孵育90 min，在536 nm處測量吸光值。

羥自由基清除活性=（As-Ac）/（Ab-Ac）×100%，

式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（包括鄰二氮菲、PBS、FeSO4和H2O2）；Ab為空白組吸光值（包括鄰二氮菲、PBS和FeSO4）。

1.3.2 超氧陰離子自由基清除實驗[9]

每1 mL反應液中包含濃度為20 mmol/L的PBS（pH=7.4），濃度為50 μmol/L的NBT，75 μmol/L的NADH，15 μmol/L的PMS和50 μL的菌液或發酵液，在37℃條件下孵育5 min，560 nm處測量吸光值。

超氧陰離子自由基清除活性=[(As-Ac）/As]×100%，

式中：As為樣品組吸光值；Ac為對照組吸光值（用蒸餾水取代樣品）。下同。

1.3.3 DPPH自由基清除實驗[10]

將DPPH溶于甲醇溶液配制成濃度為0.1 mmol/L的DPPH溶液，取此溶液2 mL分別與1 mL四株乳酸菌菌液及其發酵液混合均勻，室溫避光孵育30 min，在517 nm處測量吸光值。

DPPH自由基清除活性=[(Ac-As）/Ac]×100%，

1.4 緩解Caco-2細胞氧化損傷能力評價

1.4.1 氧化損傷模型構建

用MTT法[11]確定構建氧化損傷模型所需H2O2濃度，具體操作如下：Caco-2細胞以每孔1×105的濃度接種于96孔板，待細胞貼壁后開始實驗，用無血清無雙抗的 DMEM 配制濃度為0，25，50，100，150，200，250，500，1 000，2 000 μmol/L的H2O2，每孔加100 μL培養30 min，吸去H2O2，每孔加入20 μL的MTT溶液培養4 h，終止培養，每孔加入150 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min，在490 nm處測量各孔吸光值。

1.4.2 細胞分組

Caco-2細胞以每孔3×105的濃度接種于六孔板，連續培養18 d。實驗共分為9組，每組3個重復，具體分組如下，空白組；損傷組：根據2.4.1結果選擇出的最佳H2O2濃度，每孔加入3 mL濃度為500 μmol/L的H2O2，30 min后移除并清洗，DMEM繼續培養4 h；陽性對照組：氧化損傷過的細胞清洗后，每孔加入3 mL質量分數為0.01%的Vc，繼續培養4 h；NCFM組、L.p 14917組、L.p 75017組：氧化損傷過的細胞清洗后，每孔加入3 ml DMEM配制的活菌數為108mL-1的三種菌懸液，繼續培養4 h；滅活NCFM組、滅活L.p 14917組、滅活L.p75017組：氧化損傷過的細胞清洗后，每孔加入3 mL的DMEM配制的菌落數為108mL-1的三種滅活菌體的菌懸液，繼續培養4 h。

1.4.3 抗氧化酶活性的測定

實驗結束后，用冷的無菌PBS迅速清洗3次，收集細胞，4℃條件下2 000 g離心10 min，棄上清，用1 mL冷PBS清洗，4℃條件下2 000 g離心10 min，加入1 mL質量分數為1%的Triton X-100充分混勻，4℃條件下4 000 g離心15 min，收集上清。分別測量不同處理組上清液SOD活性、GPx活性。

1.5 數據處理

實驗數據均為平行測三次的值，用平均數±標準差表示，用SPSS 17.0軟件進行統計分析，差異顯著水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 自由基清除能力

2.1.1 羥自由基清除能力

羥自由基能夠降解DNA、損傷細胞膜和多糖化合物，是最主要的能夠導致脂質過氧化和多種人體細胞損傷的自由基[12,13]，在本研究中，羥自由基來源于Fenton反應。圖1為3株乳酸菌羥自由基清除活性。

圖1 3株乳酸菌羥自由基清除活性

由圖1可以看出，3株乳酸菌菌體及發酵液均有一定的羥自由基清除能力。其中菌體的羥自由基清除能力分別為NDC75017（79.87%±0.027）＞ATCC14917（69.74%±0.008）＞NCFM（65.17%±0.042），發酵液羥自由基清除能力分別為NDC75017（32.13%±0.017）＞ATCC14917（23.65% ± 0.025）＞NCFM（17.28% ±0.018）。分析其結果可發現，在羥自由基清除活性方面3株乳酸菌菌體均大于發酵液，其中植物乳桿菌NDC75017表現出最強的羥自由基清除活性，乳酸菌菌體具有較強的羥自由基清除能力可歸結為在乳酸菌細胞內存在著針對Cu2+和Fe2+的天然螯合物質，這些物質能夠螯合Cu2+和Fe2+，從根本上減少羥自由基的產生[6]。

2.1.2 超氧陰離子自由基清除能力

由PMS/NADH組成的非酶促反應系統可以產生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基能夠將NBT還原成紫色的甲瓚，甲瓚在560 nm處具有最強的吸光值，在反應過程中加入3株乳酸菌菌體或發酵液，通過吸光值的減少量可計算出超氧陰離子清除率。圖2為3株乳酸菌超氧陰離子自由基清除活性。

圖2 3株乳酸菌超氧陰離子自由基清除活性

由圖2可以看出，3株乳酸菌菌體超氧陰離子自由基清除率為NDC75017（39.45%±0.040）＞ATCC14917（23.63%±0.015）＞NCFM（15.25%±0.013），發酵液超氧陰離子自由基清除率為ATCC14917（63.62%±0.036） ＞NDC75017（51.83% ± 0.029） ＞NCFM（35.40%±0.031）。在超氧陰離子自由基清除活性方面3株乳酸菌發酵液均大于菌體，其中菌體方面植物乳桿菌NDC75017表現出最強的超氧陰離子自由基清除活性，發酵液方面植物乳桿菌ATCC14917的發酵液具有最強的超氧陰離子自由基清除能力。乳酸菌菌體及發酵液具有超氧陰離子自由基清除能力可能是由于其菌體細胞及代謝產物中存在SOD，有報道顯示，SOD、CAT、NADH氧化酶和NADH過氧化物酶等都存在于乳酸菌中，并且這些抗氧化酶是乳酸菌防御氧化應激的重要酶促防御系統[14]。

2.1.3 DPPH自由基清除能力

目前，清除DPPH自由基實驗被廣泛應用于抗氧化能力評價實驗中，其原理是，DPPH自由基含有單電子，在517 nm處有一強吸收，其醇溶液呈紫色，當有自由基清除物質存在時，自由基清除物質會提供H+與DPPH中單電子對配對而使DPPH醇溶液褪色，吸光值也降低。圖3為3株乳酸菌DPPH自由基清除活性。

圖3 三株乳酸菌DPPH自由基清除活性

由圖3可以看出，3株乳酸菌菌體DPPH自由基清除率為 ATCC14917（16.55%±0.016）＞NDC75017（13.32%±0.017）＞NCFM（5.99%±0.002），發酵液DPPH自由基清除率為NDC75017（55.13%±0.032）＞ATCC14917（38.02% ± 0.015）＞NCFM（22.55% ±0.018）。在DPPH自由基清除活性方面3株乳酸菌發酵液均大于菌體，其中菌體方面植物乳桿菌ATCC14917表現出最強的DPPH自由基清除活性，發酵液方面植物乳桿菌NDC75017的發酵液具有最強的DPPH自由基清除能力。有報道顯示，乳酸菌具有DPPH自由基清除活性可能和菌體產生的胞外多糖有關，Xu等[15]的研究顯示DPPH自由基的清除活性與由雙歧桿菌分離出的胞外多糖的濃度呈正相關。

2.2 緩解Caco-2細胞氧化損傷能力評價

2.2.1 過氧化氫濃度的選擇

為構建合理的氧化損傷模型需要對H2O2的濃度進行選擇，本研究選擇0，25，50，100，150，200，250，500，1000，2000 μmol/L的 H2O2，與Caco-2細胞分別接觸30 min和1 h后，測定細胞存活率。圖4為過氧化氫濃度與細胞存活率關系。

圖4 過氧化氫濃度與細胞存活率關系

由圖4可以看出，過氧化氫與細胞生長狀態之間存在著一定的關系，與H2O2接觸后Caco-2細胞活性呈現先略微上升后急速下降的趨勢，這與楊瑞華[16]等研究所稱低濃度的過氧化氫可刺激細胞增殖這一結論相吻合。Wijeratne[18]等研究顯示，構建氧化損傷模型的原則為僅讓細胞處于氧化損傷的環境下，使細胞做出氧化損傷應答，但并不會導致細胞大量死亡，細胞存活率大約維持在95%左右為宜。目前大量研究顯示，當Caco-2細胞接觸的H2O2濃度＞500 μmol/L，時間長于1 h則會引起細胞死亡或脫壁，因此根據本實驗結果及參考文獻，最終選擇H2O2濃度為500 μmol/L，處理時間為30 min。

2.2.2 抗氧化酶活性的測定

表1 不同處理組抗氧化酶活性

如表1所示，SOD活性方面，與空白組相比，氧化損傷組SOD活性顯著降低，說明Caco-2細胞已受到氧化損傷，Wijeratne等[17]研究顯示當Caco-2細胞處于不同濃度H2O2的條件下，隨著H2O2濃度的升高，Caco-2細胞胞內SOD活性呈現先上升后下降的趨勢，當細胞處于氧化環境下，首先通過增加胞內SOD的活性來緩解其受到的氧化損傷，當氧化物的濃度達到一定值時將會對細胞造成損傷，SOD的活性也因此受到損傷因此而顯著下降。與損傷組相比，3株乳酸菌活菌處理組SOD活性均顯著升高，且L.p14917組和L.p75017組已與空白組沒有顯著差別；但3株乳酸菌滅活菌體組SOD活性變化均不顯著。

GPx活性方面，與空白組相比，氧化損傷組GPx活性顯著升高，說明Caco-2細胞在低濃度H2O2環境中也會呈現GPx活性上升的趨勢，以緩解其受到的氧化損傷。與損傷組相比，3株乳酸菌活菌處理組GPx活性均顯著下降，其中以L.p75017組效果最為明顯，GPx活性恢復到與空白組沒有顯著差異，其次是L.p 14917組，最后為NCFM組；但3株乳酸菌滅活菌體組GPx活性變化均不顯著。

3 結果與討論

自由基清除能力是評價物質抗氧化能力的重要指標，目前大量研究顯示乳酸菌發揮抗氧化作用與其具有自由基清除能力密切相關[18]。Deeplina等由發酵乳飲料中分離出1株具有抗氧化活性和高產GABA的植物乳桿菌DM5，并通過清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基等實驗證實了其具有較強的抗氧化能力[9]。Takashi等自魚腸道及發酵魚中分離出了75株乳酸菌，通過DPPH自由基清除實驗、超氧陰離子自由基清除實驗及Fe還原能力實驗，從中篩選出了6株具有較強抗氧化活性的菌株，其中4株為植物乳桿菌，1株為戊糖片球菌，1株為乳酸乳球菌[19]。本研究也對3株乳酸菌的自由基清除能力進行了比較，由實驗結果發現，在3株乳酸菌的菌體及發酵液中，菌體的羥自由基清除率要優于發酵液，而發酵液的DPPH自由基、超氧陰離子自由基清除能力要優于菌體；植物乳桿菌NDC 75017菌體具有最強的羥自由基清除能力；植物乳桿菌NDC 75017的發酵液具有最強的DPPH自由基清除能力，植物乳桿菌ATCC 14917發酵液具有最強的超氧陰離子自由基清除能力。因此，乳酸菌菌體自身的成分以及發酵液中的部分代謝產物能夠起到清除自由基的作用，不同菌株清除自由基的活性成分不同且清除能力也不同，它們能夠清除機體多余的自由基，防止自由基對機體細胞造成損傷，這也是乳酸菌發揮抗氧化作用的機制之一。

另一方面，抗氧化酶也是發揮抗氧化作用的重要重要物質，它們普遍存在于機體各個細胞內，主要包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等，當機體受到外界不良環境的刺激，抗氧化酶就會做出相應的應答[20]。Gao等分析了一株植物乳桿菌FC225的抗氧化機制，證實了其能夠顯著提升高血脂小鼠肝細胞中SOD和GPx活性，降低肝細胞中丙二醛（MDA）的含量；接著又從細胞通路角度證實其發揮抗氧化作用可能與提高Nrf2基因表達量有關[10]。李盛鈺等發現植物乳桿菌C88在活菌數達1011mL-1濃度下，能夠顯著提高受到氧化損傷的Caco-2細胞細胞裂解液中GPx活性、SOD活性、羥自由基清除率和總抗氧化（T-AOC）能力，對由H2O2誘導引起的Caco-2細胞氧化損傷起到一定的保護作用[21]。本研究證實了3株乳酸菌活菌能夠不同程度的緩解由H2O2所造成的Caco-2細胞氧化損傷，尤其是植物乳桿菌NDC 75017具有最為顯著的緩解SOD活性降低及GPx活性激增的效果，可能是菌體產生的胞外多糖及多種代謝產物起到了一定的抗氧化作用，但3株乳酸菌滅活菌體對Caco-2細胞氧化損傷的緩解作用并不明顯，可能是在滅活過程中抗氧化成分也隨之失效。

綜上所述，植物乳桿菌NDC 75017在清除自由基和緩解由H2O2誘導引起的Caco-2細胞氧化損傷方面均具有顯著效果，是一株具有較強抗氧化功能的菌株。

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