牛奶中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)

姜芳，李梅，王丹慧，宋娜娜，侯令芹，劉江梅，王丹

（內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（北京）有限責(zé)任公司，北京101107）

0 引言

鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體后累積可以導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性，因此，各國(guó)都對(duì)其作出限量要求，中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)-2002動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量鏈霉素200 ng/mL、雙氫鏈霉素200 ng/mL、卡那霉素100 ng/mL。鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素殘留量的常規(guī)檢測(cè)方法主要有微生物法[1]、高效液相色譜技術(shù)[2-6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）[7]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定[8-11]等，由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程以及對(duì)檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控大量樣本的篩查。本文的目的就是介紹快速靈敏地檢測(cè)牛奶中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留的方法--反競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析檢測(cè)法，該方法為定性檢測(cè)，其特點(diǎn)是簡(jiǎn)單快速、特異敏感，并且同時(shí)出具多個(gè)結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和設(shè)備

鮮奶樣,12%復(fù)原乳,生乳脂肪層的奶樣。

試劑：雙氧水,碳酸氫鈉,青霉素，糊精，三聚氰胺，氯化銨，深圳易瑞公司鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素二聯(lián)定性檢測(cè)試紙條。

儀器渦旋混合儀，加熱孵育器，單移液器（20-200 μL），多通道移液器（30～300 μL），讀數(shù)儀。

2 方法

2.1 干擾物質(zhì)的配制備

分別取不含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)與含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的生乳做本底，分別制備出質(zhì)量濃度為20 mg/L雙氧水摻假樣品、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%碳酸氫鈉摻假樣品、100 μg/kg青霉素抗生素?fù)郊贅悠贰?.2%糊精摻假樣品、0.1%三聚氰胺摻假樣品、0.1%銨鹽摻假樣品。

2.2 具體檢測(cè)步驟

（1）調(diào)節(jié)溫育器溫度至40℃，并穩(wěn)定在（40±1）℃；

（2）實(shí)驗(yàn)前將試劑和樣品恢復(fù)至室溫；

（3）取出所需要數(shù)量的試劑微孔，吸取200 μL待測(cè)樣品于試劑微孔中，5～10次抽吸，混合均勻；

（4）迅速將試劑微孔置于溫育器中進(jìn)行第一步溫育，溫育溫度為（40±1）℃，時(shí)間為 3 min；

（5）第一步溫育結(jié)束后，取出所需數(shù)量試紙條,海綿端朝下,插入到微孔中開(kāi)始第二步溫育，溫育溫度為（40±1）℃，時(shí)間為 6 min；

（6）第二步溫育結(jié)束后，從微孔中取出試紙條，輕輕刮去測(cè)試條下端的吸水海綿,利用讀數(shù)儀判讀結(jié)果（結(jié)果判讀必須在5 min內(nèi)完成）。

2.3 結(jié)果判定

讀數(shù)儀判讀結(jié)果：陰性為R＞1.1；陽(yáng)性為R≤1.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢出限實(shí)驗(yàn)

對(duì)生乳樣品本底、檢出限點(diǎn)及檢出限附近點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)點(diǎn)進(jìn)行平行樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1 鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)試紙條檢出限實(shí)驗(yàn)對(duì)比結(jié)果

3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

使用二聯(lián)法、鏈霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條法、卡那霉素素金標(biāo)快速檢測(cè)條法對(duì)原奶樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)點(diǎn)質(zhì)量濃度為生乳（空白實(shí)驗(yàn)）、120 ng/mL，2400 ng/mL每個(gè)點(diǎn)做10平行，符合率為100%。

3.3 干擾實(shí)驗(yàn)

3.3.1 陰性干擾

取不含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的生乳做本底，加入如下干擾物質(zhì)檢測(cè)，檢測(cè)情況如表2所示。

3.3.2 陽(yáng)性干擾

取含目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)的樣品（生乳）做本底，二聯(lián)法、鏈霉素金標(biāo)快速檢測(cè)條法、卡那霉素素金標(biāo)快速檢測(cè)條法均對(duì)加標(biāo)質(zhì)量濃度為200 ng/mL的鏈霉素、雙氫鏈霉素、卡那霉素的樣品進(jìn)行檢測(cè),在制備的陽(yáng)性樣本中加入干擾物質(zhì)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。

表2 鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)試紙條陰性抗干擾性能對(duì)比結(jié)果

表3 試紙條陽(yáng)性抗干擾性能對(duì)比結(jié)果

3.4 批量檢驗(yàn)結(jié)果

連續(xù)15日使用鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)試紙條對(duì)生乳樣品進(jìn)行檢測(cè)，每天檢測(cè)20個(gè)生乳樣品，檢測(cè)過(guò)程中所用鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)試紙條未出現(xiàn)失效、不走線等不良情況。

4 結(jié)論

由上述可以看出，鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素快速檢測(cè)反競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析檢測(cè)法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）在檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需前處理，直接檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便；

（2）整個(gè)檢測(cè)過(guò)程用時(shí)9～10 min，用時(shí)短；

（3）對(duì)陰性生乳、陽(yáng)性加標(biāo)樣品分別做了10次重復(fù)性檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果相同，重復(fù)性好。

（4）分別對(duì)陰性生乳、陽(yáng)性加標(biāo)樣品做了8類物質(zhì)的抗干擾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果一致，抗干擾能力強(qiáng)。

綜上所述，采用反競(jìng)爭(zhēng)抑制免疫層析檢測(cè)法，微孔內(nèi)含鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素特異性抗體，試紙條檢測(cè)區(qū)T1包被卡那霉素抗原，T2包被鏈霉素&雙氫鏈霉素抗原，控制區(qū)（C）包被二抗，樣品中的鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素和試紙條上預(yù)包被的抗體，抑制抗原和鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素抗體的結(jié)合。對(duì)牛奶樣品中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉

素做快速定性篩選。運(yùn)用此方法對(duì)生乳中鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素殘留量進(jìn)行篩選，與高效液相色譜技術(shù)、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS／MS）、氮磷氣相色譜檢測(cè)法、薄層色譜、氣相色譜的檢測(cè)技術(shù)相比上述方法由于復(fù)雜的儀器設(shè)備和繁瑣的過(guò)程以及對(duì)檢驗(yàn)人員的高技能要求，不適合現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控大量樣本的篩查，而此法樣本前處理簡(jiǎn)單、儀器設(shè)備投資少，檢測(cè)成本低，可作為鏈霉素&雙氫鏈霉素及卡那霉素藥物殘留快速篩選的首選方法。對(duì)于乳品企業(yè)，此法能夠保障到廠原奶及時(shí)出具檢測(cè)結(jié)果，且能夠滿足對(duì)到廠生乳及定容奶倉(cāng)的定性篩選排查，可將儀器法作為此法的確認(rèn)法。

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