高靈敏間接競爭ELISA檢測羊乳樣本中的牛乳成分

王士峰，張世偉，賴心田，馮榮虎，伍聰，楊國武

（深圳市計量質量檢測研究院，廣東深圳518102）

0 引言

羊乳比牛乳更接近人乳而廣受歡迎[1]，由于產量有限，市場價格較高。因暴利驅使，在羊乳中非法添加價廉牛乳等侵害消費者權益的事件時有發生。目前羊奶摻假牛奶主要檢測方法包括電泳或等電聚焦[2-3]，色譜技術[4]，PCR 技術[5-6]，免疫學技術[7-11]及電子鼻技術[12]等。歐盟推薦檢測方法為檢測牛乳γ-酪蛋白（γ-casein，γ-CN）的等點聚焦技術，但操作繁瑣，對人員素質要求較高。相比其他方法，免疫學檢測技術（如ELISA）擁有簡單靈敏，成本低的優點，主要檢測牛乳中的蛋白成分，如β-酪蛋白（β-casein，β-CN）[7,11]，γ-CN[8]，IgG[9,10]等。牛羊乳蛋白構象相似，故針對牛乳蛋白多克隆抗體可能存在交叉反應；抗牛注入IgG的抗體特異性最高，但牛乳中IgG歷經高溫易變性，不適用于檢測加熱處理過的樣本。danbairotein大，大師和本研究在前人的基礎上，針對牛乳酪蛋白中含量最高的β-CN制備特異單克隆抗體，建立高靈敏可檢測加熱處理樣本的ELISA方法，為國內羊乳摻偽的執法檢測提供技術支持。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 抗原和實驗動物

1.1.2 材料與試劑

標準品脫脂羊乳粉和脫脂牛乳粉，實驗前用去離子水稀釋為蛋白質量分數為3%的“復原乳”。生牛乳和生山羊乳分別采集于廣東省深圳市和廣州市本地農場，分裝-20℃保存，使用前室溫解凍，渦旋震蕩后備用。標準品乳粉和生乳均經過SN/T 2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法》檢測，證明不含其他非本物種乳成分。另外本地超市和網購收集商品化羊乳粉，嬰幼兒配方羊奶粉，滅菌全脂山羊乳，以及本地小區實地收集上門配送的純山羊乳。α-CN、γ-CN、TMB、明膠、大豆球蛋白、乳白蛋白和牛血清白蛋白（BSA）購自sigma公司；HRP標記山羊抗小鼠二抗購自Proteintech公司。其他實驗試劑均為國產分析純，實驗使用水均為去離子水。ELISA其他溶液配方見文獻[13]。

1.1.3 儀器與設備

酶標儀，96孔酶標板和細胞培養瓶，洗板機，電熱恒溫振蕩水槽，手持式酸度計等其他常規實驗儀器。

1.2 方法

1.2.1 抗體制備

用尿素溶液配置β-CN母液，用PBS稀釋為質量濃度200 μg/mL，和等體積免疫佐劑Quickantibody等體積混勻，小鼠大腿肌肉免疫100 μg/只，第21天等劑量加強免疫，第35天后尾部采血檢測，測量血清多抗效價。單克隆抗體及腹水制備方法見文獻[14]。

1.2.2 ELISA方法

使用本文中的5種焊接材料分別焊接無壓W1基材與45鋼母材，用微機控制萬能材料試驗機進行剪切試驗，試驗結果見表5。

用棋盤滴定法確定包被抗原、一抗、樣品和酶標二抗稀釋倍數。其他ELISA條件：96微孔板每孔用100 μL適當濃度β-CN包被，4℃孵育過夜，次日棄上清，用200 μL含有質量分數2%BSA的PBST溶液37℃封閉2 h，棄上清用PBST洗滌5遍拍干后，微孔板可密封4℃保存或立即使用。

間接競爭ELISA：取封閉好的微孔板室溫平衡30 min，先加入50 μL標液或檢測樣本稀釋液，再加入50 μL適合濃度單抗稀釋液，37℃反應30 min，棄上清洗滌拍干后，加入HRP標記山羊抗小鼠二抗100 μL，37℃反應30 min，洗滌拍干后，加入TMB顯色液，避光37℃反應10 min后，加入50 μL終止液終止反應，酶標儀450 nm檢測吸光度值。

1.2.3 間接競爭ELISA標準曲線

本研究中選用的標準品脫脂牛乳粉蛋白質量分數為33.5%左右，先用去離子水制備蛋白質量分數3%的復原牛奶，先用PBST倍比稀釋，按照優化好的ELISA條件進行競爭實驗，每個濃度4個重復，建立logit-log回歸標準曲線。

1.2.4 熱穩定性與交叉反應

將生牛奶62℃水浴加熱30 min，即得到巴氏殺菌乳；生牛乳121℃高壓蒸汽滅菌20 min，即為高溫滅菌乳。將生牛奶、巴氏殺菌乳、高溫滅菌乳和復原牛乳用PBST倍比稀釋，繪制競爭曲線。間接競爭ELISA檢測不同蛋白樣本的交叉反應率。交叉反應率=牛奶蛋白IC50/其他蛋白IC50×100%。

1.2.5 回收率與精密度

用復原牛乳和復原羊乳配置含20%，10%，5%，1%牛乳的羊乳樣本，每質量分數4個重復，檢測羊奶中牛奶比例，計算添加回收率：回收率=測量值/添加值×100%。同理計算相對標準偏差。

1.2.6 實際樣本檢測

稱取等量標準品脫脂牛乳粉和待檢乳粉樣本，先用等量水稀釋標準品和樣本配置復原乳，再用PBST適當稀釋，檢測標準品和樣本中的牛奶蛋白質量分數；液態鮮羊乳樣本可直接用PBST稀釋檢測牛奶蛋白質量分數。樣品中牛奶比例=蛋白質量分數（樣本）/蛋白質量分數（標準品）×100%。

2 結果與分析

2.1 ELISA條件優化

圖1 包被抗原及一抗稀釋倍數優化

棋盤法確定包被抗原，一抗稀釋倍數，結果如圖1所示。選用OD450接近1.0為最佳濃度，最終確定β-CN包被質量濃度為1 μg/mL，多抗的稀釋倍數為1∶8 000，篩選到的雜交瘤細胞株命名為3B9。用類似方法確定3B9單抗稀釋倍數為1∶100 000。

圖2 競爭抗原及酶標二抗稀釋倍數優化

確定鮮乳及復原乳稀釋倍數為100倍，二抗稀釋倍數為1∶2000，結果如圖2所示。由于鮮乳及乳制品成分復雜，推薦先將鮮乳（鮮乳蛋白含量3%左右）用PBST稀釋100倍后進行實驗；關于乳粉制品，先配置成蛋白質量分數3%左右的復原乳，稀釋100倍后進行實驗，此舉有助于統一樣品間的緩沖環境，提高ELISA系統穩定性。

2.2 多抗和單抗B39特異性比較

采用上述ELISA條件，使用血清多抗和3B9分別與復原牛奶和復原羊奶進行交叉反應，結果如圖3和圖4所示。由圖3和圖4可以看出，單抗3B9特異性明顯優于血清多抗，但在樣品濃度高的情況下，單抗與羊奶之間存在輕微交叉反應，可能是由于蛋白濃度過高抑制了系統反應，隨著稀釋倍數增加，交叉反應逐漸消失，說明3B9適用于建立ELISA方法。

2.3 熱穩定性與交叉反應

用建立的ELISA方法檢測生牛奶、巴氏滅菌乳、高溫滅菌乳，選用標準品復原牛乳做對照，結果如圖5所示。由圖5可以看出，FDS乳生牛奶、巴氏滅菌乳、高溫滅菌乳和標準批內務生牛奶、巴氏殺菌乳和高溫滅菌乳的競爭抑制曲線并無明顯不同，表明即使高達121℃高溫并未對抗體識別表位造成影響。所以該方法適用于檢測高溫處理的液態乳和乳粉制品。

圖3 血清多抗和牛羊乳間接競爭曲線

圖4 單抗3B9和牛羊乳間接競爭曲線

圖5 不同熱處理乳的競爭曲線

B39抗體的交叉反應結果如表1所示。表1中，B39與各種牛酪蛋白均存在交叉反應，故本研究中選用牛奶總蛋白做標準競爭抗原；另外，抗體與羊奶總蛋白，大豆奶，BSA等常用蛋白樣品無交叉反應，故特異性滿足一般檢測需要。

表1 mAb3B9交叉反應率

2.4 間接競爭ELISA標準曲線

令橫坐標x=lg（蛋白濃度），y=In（B/B0），得到抑制回歸曲線y=-0.92988-0.90047x，相關系數r2=0.9 966，線性檢測范圍為2.68 ng ～ 3.21 μg/mL，半數抑制質量濃度IC50值為92.8 ng/mL，最低檢測限0.35 ng/mL。其中，B0為PBST空白對照OD450，B為不同實驗組OD450。

2.5 回收率與精密度檢測

采用ELISA檢測不同比例摻雜樣本，結果如表2所示。由表2可以看出，樣本平均回收率在121%，平均相對標準偏差為9.7，最大值不超過12%，表明該方法重復性好，但回收率偏大，濃度越低時偏差越大。由于樣本要經過上百倍稀釋，極易引起結果偏差，但是對一般檢測半定量檢測需要已經足夠。

表2 牛奶添加回收率

2.6 實際羊乳粉樣本

分別采用ELISA方法和SN/T 2051-2008實時PCR法檢測收集的配方羊奶粉和液態山羊奶樣本。如表3所示，熒光PCR共檢測到8個樣本有?；虺煞?，但是ELISA分析只有7個。結果顯示由于標準缺失，市面上羊乳粉摻雜牛乳的情況確有發生，需要執法部門加強監管；此外熒光PCR顯示出極高的靈敏性，但無法得出定量參考結果，而ELISA陽性結果中，2個樣品添加低于5%，此程度摻雜利潤已經不大，究其原因可能是生產加工過程中無意污染，相比那些大比例摻假，低于5%的陽性樣本理應區別對待。

表3 實際羊奶樣本檢測

3 結論

本研究制備特異識別牛酪蛋白的單克隆抗體3B9，建立了可半定量檢測羊乳樣本中牛乳成分的間接競爭ELISA，理論最低檢測限為3.24 ng/mL，顯示出較高的靈敏度，且重復性好。該方法比基于多抗的ELISA擁有更高的靈敏度，且樣品熱處理不會對檢測結果有明顯影響。雖然該方法的靈敏度不及熒光PCR，但是操作時間短，步驟簡單，技術要求低，適用執法大規模高通量篩查，此外可半定量檢測樣品中的牛奶蛋白成分，可排除微量無意污染樣本，提高執法公正性。

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